Přínos genetického testování EUS-navigovaných bioptických vzorků v diferenciální diagnostice ložiskových lézí pankreatu

1,2 Šálek C, 1 Zavoral M, 1 Nosek V, 2 Benešová L, 2 Kašperová L, 3 Traboulsi E, 2 Minárik M

1 Oddělení gastroenterologie, hepatologie a metabolismu Interní klinika 1. LF UK a ÚVN, Praha
Přednosta: Doc. MUDr. Miroslav Zavoral, Ph.D.
2 Laboratoř molekulární genetiky a onkologie, Genomac International, s. r. o., Praha
3 Oddělení patologie ÚVN, Praha
Primář: MUDr. Petr Hrabal, CSc.

Úvod a cíle studie

EUS-asistovaná tenkojehlová aspirační biopsie/cytologie (FNA) je považována za standardní součást vyšetření u pacientů s ložiskovým postižením pankreatu. Jde o vysoce senzitivní metodu schopnou detekovat útvary o průměru pod 20 mm, tedy menší než je rozlišovací schopnost spirálních CT nové generace (1). Metoda je však značně závislá na zkušenostech endoskopisty a vykazuje interindividuální variabilitu v hodnocení endoskopických nálezů.

Karcinom pankreatu je moderní medicínou považován za genetické onemocnění (2). Jeho vznik a progrese jsou provázeny sekvenční akumulací genetických změn, z nichž nejvíce pozornosti je zaměřeno na onkogen K-ras a tumor supresoro-vé geny p16, p53 a DPC4 (3-6). Jejich přítomnost byla prokázána již v preneoplastických lézích pankreatu (PanIN lézích), proto představují potenciální markery malignity pro účely diferenciální diagnostiky a screeningu (7,8).

Výsledky genetického výzkumu recentně proběhnuvšího na pracovišti Interní kliniky 1. LF UK a ÚVN v Praze vykazují následující statistické hodnoty pro karcinom pankreatu (9):

- mutační analýza K-ras: senzitivita 70 % (95% CI [60 % až 80 %]), specificita 100 %, p<0,001;

- mutační analýza p53: senzitivita 24 % (95% CI [14 % až 34 %]), specificita 90 % (95% CI [85 % - 95 %]), NS;

- mutační analýza p16: senzitivita 13 % (95% CI [7 % až 19 %]), specificita 100 %, NS;

- ztráta heterozygozyty (LOH) chromosomu 9p (lokace genu p16): senzitivita 85 % (95% CI [75 % - 95 %]), specificita 64 % (95% CI [53 % - 75 %]), p<0,001;

- LOH chromosomu 18q (lokace genu DPC4): senzitivita 78 % (95% CI [67 % - 89 %]), specificita 57 % (95% CI [45 % - 69 %]), p<0,05.

Cílem tohoto pojednání je zhodnotit přínos genetických analýz pro diferenciální diagnostiku suspektních ložiskových lézí pankreatu pro klinickou praxi.

Metodika

Analytický soubor tvořilo 90 konsekutivních pacientů (54 mužů, 36 žen, střední věk 60 _ 12 let), kteří podstoupili EUS-navigovanou FNA pro ložiskové postižení slinivky břišní. V 81 případech byl diagnostikován karcinom pankreatu, 8 pacientům byla stanovena diagnóza chronické pankreatitidy, jeden pacient s benigním adenomem byl z analýz vyloučen. EUS prováděl jeden zkušený endoskopista, FNA vzorky byly získány 17–19 Gauche punkční jehlou a po rychlém obarvení rychlou H&E řadou on-site hodnoceny cytologem na přítomnost suspektních buněk. Definitivní diagnóza byla stanovena zkušeným cytopatologem po obarvení zbylých cytologických nátěrů metodou dle Giemsy.

Cytologické nátěry byly podstoupeny ke genetické analýze. DNA byla izolována po laserové mikrodisekci nádorově, popř. zánětlivě změněných duktálních epitelií. Mutační analýza onkogenu K-ras byla zaměřena na kodony 12 a 13 v exonu 1; metodicky bylo užito amplifikace příslušných úseků metodou PCR a následné heteroduplexové analýzy s využitím kapilární elektroforézy v cyklujícím teplotním gradientu (10).

Delece tumor supresorových genů p16 a DPC4 byly monitorovány metodou detekce ztráty heterozygozity (LOH) sady mikrosatelitních markerů na krátkém raménku 9. a na dlouhém raménku 18. chromosomu. Pro vyhodnocení byl porovnáván signál amplifikátů DNA nádorové tkáně se signálem získaným z DNA leukocytů téhož pacienta.

Výsledky

Endosonografickým vyšetřením bylo dosaženo senzitivity 94 % a specificity 77 % v diagnostice karcinomu pankreatu. Pět z 89 (6 %) případů bylo falešně negativních, dva (2 %) falešně pozitivní. U deseti pacientů (11 %) endoskopista nebyl na základě EUS obrazu schopen diferencovat mezi maligním a benigním charakterem léze.

Cytologické vyšetření nátěrů FNA vykázalo senzitivitu i specificitu 100 %. Nález na 23 z 89 (26 %) však neumožňoval spolehlivě rozlišit mezi buněčnými atypiemi původu maligního a zánětlivého, a proto byl patologem hodnocen jako nekonkluzivní.

Ke zvýšení diagnostické výtěžnosti EUS vyšetření byly aplikovány kombinace genetických metod, které dle výsledků našeho recentního výzkumu vykazují statistickou závažnost. Výsledky jsou shrnuty v následujícím přehledu:

- kombinace testů K-ras a LOH 9p: senzitivita 92 % (95% CI [85 % - 99 %]), specificita 64 % (95% CI [53 % - 75 %]), p<0,001;

- kombinace testů K-ras a LOH 18q: senzitivita 92 % (95% CI

genetické testy = mutace K-ras + LOH 9p (p16) + LOH 18q (DPC4)

[85 % - 99 %]), specificita 57 % (95% CI [45 % - 69 %]), p<0,001; - kombinace všech tří testů (K-ras, LOH 9p, LOH 18q): sen-zitivita 96 % (95% CI [92 % - 100 %]), specificita 43 % (95% CI [31 % - 55 %]), p<0,001.

Pokud byly výsledky cytologického vyšetření FNA a genetických testů hodnoceny současně, žádný z nálezů nebyl ne-konkluzivní, žádný nález nebyl falešně negativní, jeden (1 %) byl falešně pozitivní. Výše uvedené výsledky jsou shrnuty v tabulce.

EUS FNA

genetika

EUS+FNA

FNA+genetika

všechny tři

nekonklusivní

10/89 11,2 %

23/89 25,8 %

12/89 13,5 %

5/89 5,6 %

5/89 5,6 %

0/89 0 %

falešně negativní

5/79 6,3 %

0/66 0 %

2/77 2,6 %

4/84 4,8 %

0/84 0 %

0/89 0 %

falešně pozitivní

2/79 2,5 %

0/66 0 %

5/77 6,5 %

1/84 1,2 %

1/84 1,2 %

1/89 1,1 %

Tabulka 1 - Výtěžnost EUS, FNA a genetických testů v diferenciální diagnostice ložiskových lézí pankreatu

Závěr

Kombinace EUS - navigované FNA a genetického vyšetření zaměřeného na mutační analýzu onkogenu K-ras a detekci alelických ztrát na chromosomech 9p a 18q představuje vysoce senzitivní metodu v diagnostice maligních ložiskových lé-zí exokrinního pankreatu. Genetické testy lze doporučit jako doplňkové vyšetření zejména tam, kde FNA nález byl nekon-kluzivní. Jsou potenciálně využitelné i ve screeningu pankrea-tických malignit u osob se zvýšeným rizikem.

Projekt byl podpořen grantem č. 8027/3 IGA MZ ČR.

Literatura

1  - Gress FG, Hawes RH, Savides TJ, Ikenberry SO, Cummings O, Kopecky K, Sherman S, Wiersema M, Lehman GA:Role of EUS in the preoperative staging of pancreatic cancer: a large single-center experience. Gastrointest Endosc, 1999, 50: 786 - 91

2   - Hruban RH, Iacobuzio-Donahue C, Wilentz RE,

Goggins M, Kern SE: Molecular pathology of pancreatic cancer. Cancer J, 2001, 7: 251 - 8

3 - Almoguera C, Shibata D, Forrester K et al: Most human carcinomas of the exocrine pancreas conctain mutant c-K-ras genes. Cell, 1988, 53: 549 - 54

4 - Schutte M, Hruban RH, Geradts J et al: Abrogation of the Rb/p16 tumor-suppressive pathway in virtually all panc-reatic carcinomas. Cancer Res, 1997, 57: 3126 - 30

5 - Hahn SA, Schutte M, Hoque AT et al: DPC4: a candida-te tumor suppressor gene at human chromosome 18q21.1. Science, 1996, 271: 350 - 3

6 - Moskaluk CA, Hruban RH, Kern SE: p16 and K-ras gene mutations in the intraductal precursors of human pancre-atic adenocarcinoma. Cancer Res, 1997, 57: 2140 - 3

7 - Hruban RH, Goggins M, Parsons J et al: Progression model for pancreatic cancer, Clin Cancer Res, 2000, 6: 2969 -2972

8  - Hruban RH, Adsay N V, Albores-Saavedra J et al: Pancreatic intraepithelial neoplasia (PanIN): A New no-menclature and classification system for pancreatic duct le-sions. Am J Surg Pathol, 2001, 25: 579 - 586

9 - Šálek C, Zavoral M, Nosek V, Benešová L, Kašperová L, Ryska M, Strnad R, Traboulsi E, Minárik M: Detekce somatických mutací onkogenu K-ras a alelických ztrát na chromosomech 9p a 18q zvyšuje diagnostickou výtěžnost EUS-navigované tenkojehlové biopsie u pacientů s ložiskovým postižením pankreatu. Čes a Slov Gastroent a Hepatol 2006, (v přípravě).

10 - Minárik M, Mináriková L, Bjorheim J et al: Cycling gradient capillary electrophoresis: a low-cost tool for high-throughput analysis of genetic variations. Electrophoresis, 2003, 24: 1716 – 22.

Adresa pro korespondenci:
MUDr. Cyril Šálek
Interní klinika 1.LF UK a ÚVN Praha
U Vojenské nemocnice 1200
169 02 Praha 6
cyril.salek@uvn.cz