ročník 13,2005 č.3-4
Přehledné články

Transplantace hepatocytů - současný stav

Koblihová E.

Chirurgická klinika 2. LF UK a ÚVN Praha
Přednosta: Prof. MUDr. Miroslav Ryska, CSc.

Transplantace jater jako orgánu představuje jedinou kauzální terapeutickou metodu v léčbě akutního a chronického jaterního selhání a v léčbě dědičných poruch metabolismu. Ne vždy se nalezne vhodný dárce orgánu. Proto je snahou hledat jiné alternativní metody zvyšující přežívání pacientů s jaterním onemocněním. Jednou z nich je transplantace jaterních buněk.
Výhody transplantace hepatocytů oproti transplantaci jater jako orgánu:
Transplantace jaterních buněk je relativně jednoduchý výkon, možný provádět ambulantně, metoda je pro nemocného méně invazivní. Při přenosu jaterních buněk očekáváme nižší imunologickou odpověď organismu, proto lze snížit množství podávaných imunosupresiv. Hepatocyty získané z jednoho orgánu lze použít pro více příjemců. Jaterní buňky je navíc možné zmrazit a uchovat, přičemž zůstává zachována jejich proliferační schopnost. Transplantaci hepatocytů je možné použít k překlenutí doby, než se nalezne vhodný dárce orgánu. Nezanedbatelné jsou nižší ekonomické náklady.

Historický vývoj

První poznámky o přenosu jaterních buněk se objevují v 60. létech 20. století. Zásadním krokem v transplantaci hepatocytů představuje metoda izolace jaterních buněk pomocí perfuze jaterní tkáně roztokem kolagenázy, kterou popsali Berry a Friend v roce 1969 (1). Tuto metodu modifikoval Seglen (1976) a je používána dodnes. První pokusy transplantace hepatocytů prováděné na zvířatech sahají do 70. let, více již do let 80. V 70. létech se také objevují umělé systémy nahrazující funkce jater, tzv. bioartefiiciální játra. První úspěšnou transplantaci hepatocytů u člověka provedli Mito a Kusano v roce 1993 (2).

Preklinické studie

Jaterní buňky se izolují perfuzí jaterní tkáně roztokem kolagenázy, jak popsali Barry a Friend a modikoval Seglen. Vetšinou se izolované buňky použijí ihned k transplantaci, ale mohou se zmrazit a uchovávat. Kryoprezervací se ale snižuje viabilita izolovaných buněk.
K transplantaci lze použít hepatocyty autologní, alogenní i xenogenního původu. V posledních létech jsou využívány genově manipulované buňky.
Nejčastějším místem přenosu hepatocytů jsou játra a slezina. Byly popsány i jiná cílová místa a orgány jako peritoneální dutina, interskapulární tuková tkáň, pouzdro ledviny, plicní parenchym či pankreas.
Transplantace hepatocytů do jater se provádí cestou vena portae. Játra představují pro přenesené jaterní buňky přirozené prostředí, ale většina hepatocytů z jater migruje do plic, kde jsou ničeny procesem fagocytózy. Při podání buněk do organismu dochází k hemodynamickým změnám - zvýšení portálního a pulmonálního tlaku s rizikem plicní embolie či trombózy vena portae, jak popisuje ve své studii Muraca et al. (3). Dalším důležitým aspektem je množství podaných hepatocytů. Uveřejněné studie hovoří až o 10 % hmotnosti jaterní tkáně. Konkrétní čísla u jednotlivých druhů experimentálních zvířat: krysy 0,1-2%, králík 1-2 %, psi 2-4 %, opice 0,75-2,4 % (3). Pokud bychom chtěli data vyjádřit v množství transplantovaných buněk na 1 gram jaterní tkáně, pak u krys je možno bezpečně přenést 2,1- 2,9 x 106 , 2 x 106 u králíků, 2,7 x 106 u psů, 2,4 x 106 u prasat a 3,3 x 106 u opic hepatocytů na gram jaterní tkáně (3). Po podání hepatocytů do v. portae putují do trámců jaterních buněk, aniž by narušovaly strukturu jaterního parenchymu.
Dalším vhodným orgánem pro přenos jaterních buněk je slezina. Hepatocyty se podají do a. lienalis nebo přímo do parenchymu sleziny. Část jaterních buněk vycestuje ze sleziny do vena portae. Hepatocyty ve slezině nejen přežívají, ale i proliferují a vytvářejí struktury podobné jaterní tkáni.
Při podání jaterních buněk do peritoneální dutiny dochází časně k jejich nekróze. Přežívání hepatocytů lze zvýšit jejich ochranou biokompatibilní membránou (4) ve formě mikrokapsulí, dutých vláken nebo 3D matrice (5).
Transplantované hepatocyty vyvolávají v hostitelském organismu imunitní reakci. Té se snažíme zabránit nejčastěji imunosupresní léčbou (kortikoidy, takrolimus, cyklosporin). K dalším alternativním metodám patří například ozáření transplantovaných buněk UVB světlem, imunoadherence s vyvázáním protilátek, blokáda ko-stimulace T-lymfocytů při interakci s APC pomocí solubilního proteinu, snížení exprese genů MHC I. třídy, ochrana hepatocytů v mikrokapsulích (6) Jak bylo ukázáno na myším modelu tyrosinémie, jaterní buňky dárce jsou schopny zcela nahradit hepatocyty příjemce a být transplantovány dále (7). Hovoří se o tzv. repopulaci jaterní tkáně.
Detekci transplantovaných hepatocytů lze provádět na základě sledování biochemických parametrů (jaterní testy, parametry koagulace), hodnot intrakraniálního tlaku, značení jaterních buněk radioaktivními izotopy (indium, technecium) a jejich následným zobrazením scintigrafií (8, 9) a biopsií tkání.

Zvířecí modely

První zmínky o transplantaci jaterních buněk u laboratorních zvířat nacházíme v 70. letech 20. století. Byly vytvořeny modely akutního a chronického jaterního selhání a modely dědičných metabolických onemocnění, aby na nich následně mohl být zkoumán přenos hepatocytů. Akutní jaterní selhání lze navodit aplikací definovaného množství galaktosaminu, nitrosaminu, mechanicky parciální hepatectomií nebo ischemií jaterní tkáně. Podáním retrorsinu nebo tetrachlororidu zvířeti navodíme chronické jaterní selhání. Genovou manipulací u zvířat získáme modely dědičných metabolických onemocnění.

Akutní a chronické jaterní selhání

Sutherland et al. představili model akutního jaterního selhání u potkanů podáním dimethylnitrosaminu s následnou léčbou transplantací jaterních buněk intraperitoneálně a intraportálně. Jako korelát stupně poškození byla sledována hladina glutamát-oxalacetické transaminázy v séru (10).
Matas a spol., Vroeman et al. transplantovali jaterní buňky u Gunnových potkanů (hereditární deficience UDP-glukuronyltransferasy) s následným poklesem hladiny bilirubinu v plazmě potkanů (11,12). Roger et al. vytvořili model akutního jaterního selhání 95 % hepatektomií u potkanů.Následná transplantace hepatocytů enkapsulovaných do systému dutých vláken v peritoneální dutině zvýšila procento přežívání potkanů. V přítomnosti transplantovaných jaterních buněk došlo k regeneraci jater potkanů(13) Papalois a spol. navodili toxické jaterní selhání u potkanů podáním N- dimethylonitrosaminu. Jedné skupině zvířat byly transplantovány čerstvě izolované hepatocyty prasat, druhé skupině podali 1 měsíc zmražené jaterní buňky prasat. Buňky byly přeneseny pod pouzdro ledviny a do parenchymu sleziny. Zmrazené hepatocyty měly nižší viabilitu, nižší antigenicitu a nižší obsah glykogenu (14).
Gagandeep et al. představili model jaterní cirhózy navozené aplikací carbon tetrachloridu u potkanů. Hepatocyty injikovali do sleziny. Následná histologie ukázala distribuci hepatocytů periportálně, kolem fibrózních sept a osídlení cirhotických nodulů transplantovanými hepatocyty. Navíc hepatocyty přežívaly více než 1 rok v játrech příjemce.

Dědičné poruchy metabolismu

Matas a spol., Vroeman et al. transplantovali jaterní buňky u Gunnových potkanů (hereditární deficience UDP-glukuronyltransferázy) s následným poklesem hladiny bilirubinu v plazmě potkanů a objevením se konjugátu bilirubinu ve žluči (11,12).
Moscioni a spol. popsali dlouhodobou korekci metabolizmu albuminu. U analbuminemických potkanů došlo po transplantaci hepatocytů k vzrůstu hladiny albuminu na téměř normální hodnoty a perzistovala až 3 měsíce od přenesení buněk do ukončení pokusu (15).
Rozga a spol. provedli přenos jaterních buněk intraperitoneálně a intraportálně u Watanabeho hypercholesterolemických králíků defektem tvorby LDH receptoru. Pozorovali signifikantní pokles sérové hladiny cholesterolu a následně i snížení tvorby aterosklerotických plátů v cévách. (16).
Na zvířecím modelu byla ukázána schopnost přenesených hepatocytů nejen zabránit rovoji jaterního selhání, ale i schopnost repopulace původní jaterní tkáně transplantovanými jaterními buňkami. Tyto poznatky vycházejí z myšího modelu tyrozinémie(17).

Klinické studie

V roce 1993 Mito a Kusano provedli první transplantaci hepatocytů u pacientům s chronickou hepatitidou a jaterní cirhózou. Hepatocyty izolované ze segmentu jater daného pacienta byly injikovány do sleziny téhož nemocného. K očekávanému klinickému zlepšení pacientů ale nedošlo (2).
Další práci na téma přenosu jaterních buněk u lidí roku 1994 publikovali Habibullah et al. Hepatocyty byly získány z lidských fétů a transplantovány do dutiny břišní pacientům s fulminantním jaterním selháním a jaterní encefalopatií III.-IV. stupně. Po 48 hodinách od transplantace bylo zaznamenáno klinické zlepšení pacientů a úprava laboratorních hodnot (18).
Strom s kolegy popsal využití transplantace jaterních buněk k přemostění doby při čekání pacienta na transplantaci jater. Směs čerstvých a zmrazených hepatocytů přenesl 5 pacientům s MOF a IV. stupněm jaterní encefalopatie.Byl zaznamenán signifikantní pokles sérové hladiny amoniaku, 3 nemocní se dočkali transplantace jater (19).

Transplantace

u dědičných metabolických onemocnění lidí V roce 1998 publikoval Fox se spolupracovníky případ desetileté pacientky s Crigler-Najjarovým syndromem. Cestou vena portae nemocné přenesly hepatocyty od pětiletého pacienta. Došlo k poklesu hladiny bilirubinu na 60 % výchozích hodnot, k vzrůstu aktivity bilirubin-uridyl glukuronyl transferázy v biop. vzorku jater a snížila se pravděpodobnost vzniku jádrového ikteru. Transplantované hepatocyty byly aktivní ještě po 9 měsících od přenosu při trvalé imunosupresivní terapii nemocné (20).
Transplantace genově manipulovaných jaterních buněk pochází z roku 1994. Pacientce s familiární hypercholesterolémií byla provedena levostranná hemihepatectomie, izolace jaterních buněk a vystavení buněk působení retroviru exprimující receptor pro LDL. Cestou v. mesenterica inf. byly transplantovány pacientce jaterní buňky v množství 2 x 109. Byl zaznamenán pokles hladin LDL a vytvoření responsibility na lovastatin (21).

Bioarteficiální podpůrné systémy

Používání a konstrukce bioarteficiálních systémů představuje zvláštní kapitolu. Tyto systémy slouží k náhradě funkce jater nejčastěji při fulminantním jaterním selhání, při akutním jaterním selhání při čekání na vhodného dárce orgánu k tzv. bridgingu pacienta (22), tj. přemostění období. Základem systému jsou hepatocyty uchycené na membráně. Membrána poskytuje hepatocytům ochranu před buňkami imunitního systému organismu a zajišťuje výživu. Jaterní buňky navázané na membránu jsou umístěny v bioreaktoru. Bioreaktor je nejčastěji tvořen systémem dutých vláken, rozdělených na 2 kompartmenty. Další možností je systém kolagenem potažených desek s hepatocyty. Dále jsou popisovány bioreaktory s enkapsulovanými hepatocyty (4).

Závěr

Výsledky preklinických studií ukazují na slibnou budoucnost využití transplantace hepatocytů v humánní medicíně. Hlavními indikačními skupinami pro přenos hepatocytů jsou získaná onemocnění - fulminantní jaterní selhání, chronické jaterní selhání, jaterní cirhóza, chronická virová hepatitida, a dědičná onemocnění - poruchy metabolismu bilirubinu (Crigler-Najjarův sy), poruchy metabolismu aminokyselin (tyrozinémie, fenylketonurie, histidinémie, homocystinurie), poruchy metabolismu alfa-1-antitrypsinu, poruchy syntézy žlučových kyselin, familiární hypercholesterolémie, Wilsonova nemoc.
Výzkumy se nyní zaměřují na zdokonalení kryoprezervačních procesů k zachování vysoké viability hepatocytů, hledání zdrojů jaterních buněk (fetální hepatocyty, progenitorové kostní buňky), možnost pěstování hepatocytů a v neposlední řadě genovou manipulaci.

Literatura

  1. Berry B.M., Friend D.S.: High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells.A biochemical and fine structural study. J. Cell Biol., 1969, 43,506-520
  2. Mito M., Kusano M.: Hepatocyte transplantation in man. Cell Transplant, 1993,2:65-74
  3. Muraca M. et al.: Intraportal hepatocyte transplantatio in the pig: A hemodynamic and histopatological study. Transplantation, 2002, Vol. 73, 890-896
  4. Smržová J., Lata J., Šimánek V., Ulrichová J.: Bioarteficiální játra - alternativa v léčbě akutního jaterního selhání, Vnitřní lékařství, 2000, 4, 218-224
  5. Ogawa K., ochoa E.R., Borenstein J., Tanaka K., Vacanti J.P.: The generation of functionally differentiated, three-dimensional hepatic tissue from two-dimensional sheets of progenitor small hepatocytes and nonparenchymal cells. Transplantation, 2004, Vol.77, 1783-1789
  6. Smržová J., Ulrichová J., Dítě P., Lata J.: Transplantace hepatocytů - současný stav a výhledy do budoucna, Vnitřní lékařství, 47, 2001, 11, 790-796
  7. Allen, K.J., Soriano, H.E.: Liver Cell Transplantation: The Road to Clinical Application, J Lab Clin Med 2001, 5, 298-310
  8. Gupta S., Lee Ch., Vemuru R.P., Bhargava K.: Indium labeling of hepatocytes for analysis of short-term biodistribution of transplanted cells. Hematology, 1994, Vol. 19, No.3, 750-757
  9. Schneider A., Attaran M., Klaus F.Gratz, Bleck J.S., Winkler M., Manns M.P., Ott M.: Intraportal Infusion of 99 m Technetium- Macroaggregated Albumin Particles and Hepatocytes in Rabbits: Assessment of Shunting and Portal Hemodynamics Changes, Transplantation, vol. 75, 3, 2003, 296-302
  10. Sutherland, D.R.R, Numata, M. et al.,: Hepatocellular Transplantation in Acute Liver Failure, Surgery, 1977., 1, 124-132
  11. Matas AJ, Sutherland DER, Steffes MV, Mauer SM, Lowe A, Simmons RL, Najárin JS.: Hepatocellular transplantation for metabolit deficiencies: decrease of plasma bilirubin in Guán rats. Science 1976, 192, 892-894
  12. Vroeman JP. Et al.: Hepatocyte transplantation for enzyme deficienty disease in congenic rats. Transplantation, 42, 1986, 130-135
  13. Roger V., Balladur P., Honiger J., Baudrimont M., Dalelo R., Calmus Y., Capeau J., Nordlinger B.: A Good Model of Experimental Acute Hepatic Failure: 95% Hepatectomy, Treatment by Transplantation of Hepatocytes, Transplantation Proceedings, Vol 27, 4, 1995, 2504-2505
  14. Papalois A. et al.: Experimental Xenotransplantation of Fresh Isolated and Cryopreserved Pig Hepatocytes: a Biochemical and Morfological Study, Transplantation Proceedings, 29, 1997, 2096-2098
  15. Moscioni A.D., Rozga J., Chen S. et al.: Long term correction of albumin levels in the Nagase analbuminemic Rat: Repopulation of liver by transplanted normal hepatocytes under a regeneration response. Cell Transplant. 1996, 5, 499-503
  16. Rozga J., Demetriou A.A.: Intraportal hepatocyte transplantation . In Mito M., Sawa M.: Hepatocyte transplantation. Karger Landes Systéms, 1997, 47-66
  17. Rhim J.A., Sandgren E.P., Degen J.L. et al.: Replacement of diseased mouse liver by hepatic cell transplantation. Science, 1994, 263:1149-1152
  18. Habibullah C.M., Syed I.H., Quamar A, et al.: Human fetal hepatocyte transplantation in patiens with fulminant hepatic failure. Transplant 1994.58:951-977
  19. Strom S.C., Chowdhury J.R., Fox I.J.: Hepatocyte transplantation for the treatment of human disease. Semin Liver Dis 1999, 19: 39-48
  20. Fox I.J., Chowdhury J., Kaufman S.S. et al.: Treatment of Crigler-Najjar syndrome type I. With hepatocyte transplantation. N.Engl.J. Med. 1998, 338, 1422-1426
  21. Grossmann M., Raper SE., Kozarsky K. et al: Successful ex vivo gene therapy directed to liver in patient with familiar hypercholesterolemia. Nature Genetics 1994,6, 335-341
  22. Strom S.C., Fisher A.R., Thompson M.T., Sanyal A.J., Cole P.E., Ham J.M., Posner: Hepatocyte Transplantation as a Bridge to Ortopic Liver Transplantation in Terminal Liver Failure, Transplantation, 1997, 63, 559-569
  23. Alison M.: Hepatocyte Transplantation and Bioarteficial Liver, Transplantation Proceedings, 2002, 34, 2702-2705
  24. Laconi E. et al.,: Long Term, Near -Total Liver Replacement of Isolated Hepatocytes in Rats Treated with Retrorsine, American Journal of Pathology, 1998, 153, 319-329
  25. Vons C. et al.: Transplantation of Hepatocytes in Nonhuman Primates: a Preclinical Model for the Treatment of Hepatic Metabolic Diseases, Transplantation, vol.72, 5, 2001, 811-818
  26. Nagata H., Ito M., Shirota Ch., Edge A., McCowan T.C., Fox I.J.: Route of Hepatocyte Delivery Affects Hepatocyte Engraftment in the Spleen, Transplantation, vol.76, 4, 2003,732-734
  27. Hepatocytes Prevents Death from Acute Liver Failure, An Experimental Study, Annals of Surgery, vol.228, 1,1998,1-7
  28. Balladur P. et al.: Transplantation of Allogeneic Hepatocytes without immunosuppresion: Long Term Survival, Surgery, 1995,vol.117, 2, 189-194
  29. Gupta S. et al.:Hepatocyte Transplantation: Back to the Future, Hepatology, 1989, 156-162

Adresa pro korespondenci:

MUDr. Eva Koblihová
Chirurgická klinika 2. LF a ÚVN Praha
U vojenské nemocnice 1200
160 00 Praha 6