ročník 13,2005 č.2
Loket 2005

Genetika a biologie kolorektálního karcinomu

* Minárik M, * * Mináriková P.

*Laboratoř molekulární onkologie, Genomac International, s. r. o., Praha
Vedoucí: RNDr. Marek Minárik, Ph.D.
** Interní klinika 1. LF UK a ÚVN
Přednosta: Doc. MUDr. Miroslav Zavoral, Ph.D.

Úvod

Kolorektální tumory typicky začínají na základě DNA mutace, případně více mutací, postihující jedinou epiteliální buňku. Jejím následným dělením dochází k hromadění dalších genetických variací v důsledku poruch přirozených opravných a kontrolních systémů DNA replikace. Dochází ke genetické nestabilitě, jejímž projevem je ztráta funkcí regulujících buněčný cyklus a vznikající nekontrolovatelné dělení buněk s vysokou invazivitou a zakládáním metastáz. Dle původu prvotní mutace lze rozlišit vrozené a sporadické formy.

Vrozené formy kolorektálního karcinomu

Přibližně 15 % kolorektálních nádorů má hereditární charakter, neboli je způsobeno vrozenou predispozicí ve formě dědičně přenášené genové poruchy. Nejznámější typy vrozených forem kolorektálního nádoru jsou Familiální adenatomatózní polypóza (FAP), Hereditární nepolypózní kolorektální karcinom (HNPCC) a tzv. Familiální kolorektální karcinom (FCC).
Familiární adenomatózní polypóza (FAP)
FAP je jedno z nejlépe definovaných vrozených kolorektálních postižení (1). Jedná se o autosomálně dominantní syndrom s prevalencí 1/8 000. Onemocnění se projevuje především jako stovky či tisíce polypů v tlustém střevě a rektu. Nejvíce pacientů s FAP vykazuje vrozenou mutaci genu APC (Adenomatous Polyposis Coli), který je lokalizován na 5. chromozómu v poloze 5q21. Postižení s APC mutací mají více než 90 % pravděpodobnost tvorby adenomů. Bez chirurgické léčby dochází u naprosté většiny FAP nemocných ve věku do 40 let k vývoji kolorektálního karcinomu. Z tohoto důvodu má screening u FAP rizikových skupin naprosto zásadní význam (viz dále). U FAP pacientů byla nalezena celá řada různých APC mutací. Klinické projevy nemoci mohou být ovlivněny polohou APC mutace, typem mutace (posun čtecího rámce vs. záměna aminokyseliny). Mezi tyto projevy patří zejména množství střevních polypů a tumorů mimo tlusté střevo. Kromě genu APC se jako další marker Familiární adenomatózní polypózy jeví výskyt vrozených mutací genu MYH, které tvoří až 15 % nemocných s projevy FAP, u kterých nebylo nalezeno poškození APC genu.
Hereditární nepolypózní kolorektální karcinom (HNPCC)
HNPCC je autosomálně dominantní postižení, které představuje přibližně 3-5 % kolorektálních nádorů. Na rozdíl od FAP ho neprovází výskyt mnoha střevních polypů (2). Toto onemocnění, též označované jako Lynchův syndrom, je primárně zapříčiněno vrozeným poškozením (mutací) některého ze skupiny tzv. "mismatch-repair genů" (MMR). Tyto geny, z nichž nejznámější jsou hMSH2 a hMLH1, zajišťují systém oprav náhodných chyb vzniklých při standardní DNA replikaci (3).
U pacientů s HNPCC postižením se může kolorektální karcinom vyskytovat současně s dalšími druhy nádorových onemocnění, například karcinomy endometria, vaječníků, dělohy, žaludku, tenkého střeva, jater nebo mozku. Z tohoto důvodu se tomuto onemocnění také říká "Cancer Family syndrome". Osoby nesoucí tuto mutaci mají přibližně 80% pravděpodobnost nádoru tlustého střeva nebo konečníku. Na rozdíl od sporadických forem kolorektálních nádorů, které postihují především levý tračník (viz dále), pacienti s HNPCC mají častěji nádory v pravém tračníku.
Familiální kolorektální karcinom (FCC)
Asi 10 % pacientů s kolorektálním karcinomem má též další rodinné příslušníky s tímto postižením, ale přesto nesplňují kriteria pro FAP nebo HNPCC. Dědičnost například nesplňuje pravidla autosomální dominance. Takové případy se označují jako Familiární kolorektální karcinom (FCC), jehož výskyt může být způsoben genetickým zapříčiněním, důsledkem zatížení vnějšími faktory, nebo prostě faktory náhodnými (4). Fcc je tak na rozhraní vrozené a sporadické formy.

Sporadické formy kolorektálního karcinomu

Více než 85 % případů kolorektálních nádorů je sporadických, vznikajících primárně na základě působení vnějších faktorů, nikoli dědičné predispozice. Současný biomedicínský výzkum nádorových onemocnění je zaměřen na jednotlivá stadia zrodu a vývoje nádoru ve snaze porozumět základním molekulárním procesům a jejich možnému ovlivnění či úplnému zastavení (5).
Vogelsteinův model
V roce 1990 Fearon a Vogelstein prezentovali důkazy o několikastupňovém modelu formace sporadického kolorektálního karcinomu (6). Tento model vývoje kolorektálního karcinomu z adenomových polypů popisuje výskyt somatických mutací u několika onkogenů a tumor supresorových genů. U onkogenů dochází v důsledku mutací k blokaci v aktivní formě, u tumor-supresorů naopak k deaktivaci po ztrátě jedné nebo obou alel následující po somatické mutaci. Tento model také předpokládá sekvenční akumulaci, při které k některým mutacím dochází v časně a k jiným v pozdější fázi transformace (obrázek).
Geny, které jsou na počátku této dráhy, jsou tumor supresorový gen APC a onkogen K-ras (Kirsten rat sarcoma). Tumor supresor APC kóduje protein s funkcí buněčné adheze a bývá mutován u téměř poloviny sporadických nádorů kolorekta, přižemž mutace nastávají většinou v jiných oblastech než při FAP. Mutace K-ras protoonkogenu, jehož produkt se účastní intracelulární signalizace, jsou detekovány u 40-60 % sporadických kolorektálních karcinomů (7). Dalším typickým projevem v pozdní fázi vývoje jsou delece na chromozomu 18q v oblasti genu DCC (Deleted in Colorectal Carcinoma). Konečně posledním z genů mutujících dle Vogelsteinova modelu je tumor supresor p53, který kóduje transkripční faktor, který má zásadní funkci při regulaci buněčného cyklu. Mutací p53 byla objevena celá řada, nejvíce v exonech 5 až 8.
Jiné geny postižené při sporadickém kolorektálního karcinomu
Kromě tzv. tumor-supresorové cesty popsané Vogelsteinovým modelem existují i jiné dráhy vzniku KR-Ca. Mezi ně patří dráhy zahrnující poruchy přirozené buněčné smrti - apoptózy. Jedná se například o mutace v genech FAS a FASL, které se primárně podílejí na vzniku a přenosu apoptotického signálu do buňky (8). Další geny, u kterých byla také vysledována souvislost s kolorektálním karcinomem, jsou COX-2, PPAR, MUC-1 až MUC-4 a další (9-12).

Genetika v prevenci a časné diagnostice KR-Ca

Genetické testování FAP a HNPCC
Testování FAP je v prvním kroku založeno na detekci zkráceného APC proteinového produktu. Tento test nazývaný "protein truncation test (PTT)" má citlivost přibližně 65 %. Falešných negativit je přibližně 20 %. Při negativním výsledku se provádí mutační analýza genu APC (13).
Testování HNPCC vyžaduje komplexnější přístup, protože je třeba se zaměřit na více potenciálních markerů, z nichž však mutace v genech hMLH1 a hMSH2 jsou nejčastější (cca 85 %). Protože typickým projevem poškození MMR genů je mikrosatelitní nestabilita (MSI), je výhodné před nákladným testováním mutací nejprve zjišťovat MSI. MSI se projevuje ve formě náhodných delecí nebo insercí skupiny nukleotidů (většinou CA párů) v nekódujících oblastech repetivních sekvencí (mikrosatelitů). Vzhledem k tomu, že k MSI dochází během replikace DNA, je tato porucha též nazývána "replication error" (RER). Nádory vykazující MSI jsou pak označovány jako RER pozitivní nebo RER+. Nejčastěji vyšetřovanými jsou delece v mikrosatelitových markerech BAT-25, BAT-26, D2S123, D5S346 a D17S2150. RER pozitivní tumory jsou následně podrobeny standardní detekci mutací v jednotlivých MMR genech sekvenční analýzou.
Genetické testování sporadických forem KR-Ca
Pro záchyt časných sporadických forem KR-Ca se využívá detekce somatických mutací ze shora popsaného Vogelsteinova modelu (obrázek).

Obr. 1 - Vogelsteinův model sporadického KR-Ca

Sledování se přirozeně zaměřuje především na geny s největší frekvencí mutací, tzn. k-ras a p53. Vyšetřovat lze bioptické vzorky polypózních tkání odebíraných endoskopickou polypektomií během kolonoskopického vyšetření. Při vyšetření je kladem důraz na maximální citlivost používaných metod mutační detekce, neboť malé populace nádorových buněk bývají skryty v mnohonásobném přebytku buněk normálních. Získané frakce mutované DNA jsou tak často pod hranicí 5 %, tedy pod úrovní citlivosti většiny běžně používaných metod.
V literatuře se stále častěji objevuje možnost genetického vyšetření ze vzorků stolice. Tento způsob je založen na detekci vybraných markerů zahrnujících jednak již zmíněné mutace k-ras a p53 a dále mikrosatelitový marker BAT-26 pro detekci HNPCC pomocí MSI (14). Největší výhodou této metody je neinvazivní povaha odběru vzorků a téměř 4x vyšší citlivost ve srovnání se běžným testem na okultní krvácení (FOBT).

Genetika v prediktivní onkologii KR-Ca

V poslední době se do popředí zájmu také dostává vyšetřování genetických markerů pro odhad prognózy, agresivity růstu nádoru a doby přežití (15). Velké naděje se také vkládají do možnosti využití molekulárních genetických markerů pro predikci léčebné odpovědi u cytostatické léčby (16).
Významný prediktivní potenciál má například sledování mikrosatelitní nestability uvnitř tumorů ve vztahu k průběhu a prognóze cytostatické léčby maligních onemocnění (17). Výsledky nedávné studie dokladují výskyt MSI a následný průkaz mutací "mismatch-repair" genů jakožto pozitivní prediktor léčebné odpovědi u pacientů se sporadickým kolorektálním karcinomem léčeným irinotecanem (18). Podobně například specifické bodové mutace nebo zvýšená exprese mohou být přímým prediktorem chemosenzitivity kolorektálních nádorů (19).

Literatura

  1. Herrera L, ed.: Familial Adenomatous Polyposis. New York, NY: Alan R. Liss Inc, 1990
  2. Lynch HT, Lanspa S, Smyrk T. et al: Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch syndromes I & II). Genetics, pathology, natural history, and cancer control, Part I. Cancer Genet Cytogenet 1991, 53: 143 - 60
  3. Marra G, Boland CR: Hereditary nonpolyposis colorectal cancer: the syndrome, the genes, and historical perspectives. J Natl Cancer Inst 1995, 87: 1114 - 1125
  4. Fuchs CS, Giovannucci EL, Colditz GA. et al: A prospective study of family history and the risk of colorectal cancer. N Engl J Med 1994, 331: 1669 - 1674
  5. Gryfe R, Swallow C, Bapat B. et al: Molecular biology of colorectal cancer. Curr Probl Cancer 1997, 5: 233 - 300
  6. Fearon ER, Vogelstein B: A genetic model for colorectal tumorigenesis, Cell 1990, 61: 759 - 767
  7. Capella G, Cronauer-Mitra S, Pienado MA. et al: Frequency and spectrum of mutations at codons 12 and 13 of the c-K-ras gene in human tumors. Environ Health Perspect 1991, 93: 125 - 131
  8. Moeller P, Koretz K, Leithaeuser F. et al: Expression of APO-1 (CD95), a member of the NGF/TNF receptor superfamily, in normal and neoplastic colon epithelium. Int J Cancer 1994, 57: 371 - 377
  9. Wu AW, Gu J, Ji JF. Et al: Role of COX-2 in carcinogenesis of colorectal cancer and its relationship with tumor biological characteristics and patients' prognosis, World J Gastroenterol 2003, 9: 1990 - 1994
  10. He TC, Chan TA, Vogelstein B. et al: PPARdelta is an APC-regulated target of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Cell 1999, 99: 335 - 345
  11. Manne U, Weiss HL, Grizzle WE: Racial differences in the prognostic usefulness of MUC1 and MUC2 in colorectal adenocarcinomas, Clin Cancer Res 2000, 6: 4017 - 4025
  12. Williams SJ, McGuckin MA, Gotley DC. Et al: Two novel mucin genes down-regulated in colorectal cancer identified by differential display. Cancer Res 1999, 59: 4083 - 4089
  13. Powell SM, Petersen GM, Krush AJ. et al: Molecular diagnosis of familial adenomatous polyposis. N Engl J Med 1993, 329: 1982 - 7
  14. Traverso G, Shuber A, Olsson L. et al: Detection of proximal colorectal cancers through analysis of faecal DNA. Lancet 2002, 359: 403 - 404
  15. Hardingham JE, Butler WJ, Roder D. et al: Somatic mutations, acetylator status, and prognosis in colorectal cancer, Gut 1998, 42: 669 - 672
  16. Adlard JW, Richman SD, Seymour MT. et al: Prediction of the response of colorectal cancer to systemic therapy, Lancet Oncol 2002, 3: 75 - 82
  17. Ribie C, Sargent D, Moore M. et al: Tumor microsatellite - instability status as a predictor of benefit from flurouracil-based adjuvant chemotherapy for colon cancer. NEJM 2003, 349: 247 - 257
  18. Fallik D, Borrini F, Boige V. et al: Microsatellite instability is a predictive factor of the tumor response to irinotecan in patients with advanced colorectal cancer. Cancer Res 2003, 63: 5738 - 5744
  19. Hashimoto Y, Ueda K, Minami K. et al: The potential clinical value of GML and the p53 gene as a predictor of chemosensitivity for colorectal cancer. Int J Clin Oncol 2001, 6: 90 - 96.

Adresa pro korespondenci:

RNDr. Marek Minárik, Ph.D.
Laboratoř molekulární onkologie
Genomac International, s.r.o., Praha