OBSAH

ročník 9,2001 č.2-3

Editorial


An easy score to define the real need for acute allograft rejection treatment in adult liver transplantation
Infekční zánět není jediným podnětem syntézy prokalcitoninu
Současné možnosti perfúze jater a její význam pro jaterní přenosy
Transplantace segmentu tenkého střeva - experimentální model

An easy score to define the real need for acute allograft rejection treatment in adult liver transplantation

Lerut, J., Thuyne, V., Talpe, S.1,
Ciccarelli, I., Roggen, F., Otte, J.B., Latinne, D.2,
Gianello, P.3

Liver Transplant Program, Université Catholique de Louvain
Saint-Luc University Hospital, 1200 Brussels - BELGIUM
Departments of :
Digestive Surgery (Prof. R. Detry)
1Pathology (Prof. J. Rahier)
2 Experimental Immunology (Prof. D. Latinne)
3Experimental Surgery (Prof. P. Gianello)

This work was supported by a grant from FNRS 3.4548.02

Introduction

Although the results of liver transplantation (LT) markedly improved during the last decade, still too many patients die during their late follow-up due to infectious, cardiovascular and tumorous complications (1,2).
Minimal immunosuppression (IS) or, even better, acceptance of the allograft without immunosuppression should therefore be the final goal of every transplant procedure in order to "convert" the transplanted patient into a "normal" human being.
The strategy of minimal or no IS is easier to obtain in LT as the liver allograft is an immunopriviledged organ. This has been demonstrated as well experimentally as clinically.
Allograft tolerance implies active interaction between donor and recipient immune systems. Allowance of interplay between the two immune systems under the umbrella of an as low as possible IS could represent a logical approach to obtain tolerance (3). The easiest way to obtain this would be to "accept" acute, even severe, allograft rejection, under tight clinical and biochemical control of the transplant clinician and the immunologist.
This prospective single center study aims to define the real incidence of rejection and rejection treatment using a simple method combining objective histopathological and biochemical scoring systems (4,5,6,7,8,9,10).

Material and methods

During the period January 1997 - July 2000, 111 liver grafts, transplanted into 108 patients, were prospectively studied in relation to incidence and treatment of rejection.
This study was approved by the institutional review board and informed consent was obtained in all patients.
All patients had a tacrolimus-low dose steroid based immunosuppression. Twenty patients included in this study also had anti-Lo-CD2a / BTI-322 (Biotransplant - USA) treatment (11). Tacrolimus level was between 6 and 10 ng/ml and steroids were withdrawn from the fourth post-transplant week onwards. All patients had standardized peri-operative care and anti-infectious chemotherapy. Follow-up was complete in all patients with a minimum of 12 months.
The initial immunosuppressive treatment was not changed at all until the routine liver biopsy was done at day 7. Liver biopsies were blindly red by two experienced transplant pathologists using Banff scoring system.
Liver biopsies were also done at day 180 and 365 and when judged necessary.
Total bilirubin, absolute and relative peripheral blood eosinophilia and platelets were monitored daily. Except for 48 hours antibiotherapy and IS no additional medications (such as antivirals, other antibiotics, ursodeoxycholic acid…) nor blood products were given in order to avoid interference with the interpretation of biochemical values.
Based on the experimental and clinical peak incidence of rejection at day 7, and on the values of bilirubin, eosinophilia and platelet modifications, Banff scores (BA-SC) at day 7 and bio-scores (BIO-SC) from day 5 to 7 were combined for analysis (4,12,13).
Biopsies were staged following the rejection activity index : 0-3 : no rejection or BA-0; 4-5 : mild rejection or BA-I; 6-7 : moderate rejection or BA-II; 8-9 : severe rejection or BA-III (4).
Progressive variation of biochemical tests for more than 48 hours from day 5 to day 7 was scored as follows : one point for elevation of total bilirubinemia, relative and absolute peripheral blood eosinophilia (> 0,600) and one point for lowering of platelets. The biochemical scores (BIO-SC) varied from 0 to 4 points.
The diagnosis of significant rejection was retained if BA-score was ł 6 and BIO-SC was > 2. Treatment of rejection was considered only if BA-SC and BIO-SC were concordant and in some cases of worrysome clinico-biochemical evolution despite of the absence of concordance between scores. The obtained results are presented in tables I, II and III.

Tab. I - Incidence of rejection during the first week post-LT

Year N d7 Ba-Score
(>/=6)
d7 Bio-Score
(> 2)
correlation
BA-BIO-Sc
1997 23 10 (43,5%) 2 (83,7%) 1«
1998 24 7 (28%) 2 (8%) 1«
1999 34 18 (58,9%) 2 (5,9%) 2«
2000 29 13 (44,8%) 2 (6,9%) 2«
Total 111 48 (43,2%) 8 (7,2%) 6 (5,4%)

One year graft and patient survival : 79.3 % and 82.4 %
« patient treated for rejection

Tab. II - Incidence of treated rejection during the first post-LT month (n = 111)

Year d 7-9 d 7 Ba-Sc d 10-30* d 7 Ba-Sc actual IS
1997 0   1 at d 11 (7) TAC
1998 0   1 at d 14 (6) TAC
1999 1 (7) 1 at d 17
1 at d 22
(7) TAC
2000 0 (9) 1 at d 16 (6) TAC
  2 (1,8%)   5 (4,5%)    
  Total 6,3%      

Tab. III - Incidence of treated rejection during the first post-LT year (n = 107)

Year d31-d365* d7 Ba-Sc Treatment Actual IS
1997 1 at d 42 (5) haemor. necrosis > Re-OLT TAC
1998 2 at d 34 (0) OKT3/ATG TAC + MMF
  d 334 (3) reduct. IS > nephrotoxicity TAC + MMF
1999 1 at d 69 (6) OKT3 (> error HCV-hepatitis !) TAC + MMF

* undesteroid withdrawal and TAC-dosage lowering

BA-score of ł 6 at day 7 were present in 48 grafts (43,2 %), BIO-score of more than 2 was seen in 8 grafts (7,2 %). Concordant BA- and BIO-scores were seen in 6 grafts (5.4 %).
All these 6 grafts needed a supplementary immunosuppressive treatment.
Treatment for acute cellular rejection (ACR) was done twice during the first 9 days and five more supplementary treatments were necessary from day 10 to 30 (first post-transplant month). Only 6.3 % of allografts needed rejection treatment during the first month.
During the first follow-up year, four more patients (3.6 %) were treated for ACR. These rejections appeared under progressive reduction and even withdrawal of IS. Three times, rejection was unequivocally diagnosed on histological basis; the fourth patient had a difficult post-LT course marked by alternative changes corresponding as well to rejection as to severe recurrent HCV hepatitis. This patient died due to viral allograft recurrence.

Discussion

Although it is claimed that the liver is an immunopriviledged organ, ACR is still frequently reported with incidences varying from 50 to 60 % (13,14).
In the absence of reliable clinical and laboratory tests, histopathologic analysis of ACR remains the diagnostic gold standard. The high incidence of ACR appeals for stronger IS, which may be responsible for high morbidity and mortality (14).
There are many indications in literature that the incidence of ACR is largely overestimated. Arguments in favor of this hypothesis are: spontaneous recovery following, even severe, ACR crisis (15,16,17); wide variation in the incidence of ACR between major transplant centers (4,13,14); similarity of results despite use of mild and aggressive IS (14,18,19,20,21,22,23); absence of influence of previous rejection episodes on graft outcome (14); unnecessity of IS in patients with sepsis and with post-transplant lymphoproliferative disease (3,24) and finally possibility to withdraw completely IS in some tolerant-patients (3,24,25,26) .
These data appeal for a need to define better the real incidence of ACR but also for a tailoring of the IS on an individual basis ("intelligent IS").
In order to fulfil this goal, objective scoring systems need to be elaborated in order to compare different experiences and also different ways of treating liver patients.
Histological rejection can be easily documented and standardized using the Banff or Hubscher classification (4,5). More difficulties exist in relation to the objective evaluation of biochemical variations. It is accepted that biochemical tests must worsen progressively for more than 48 hours and this ideally at the moment of peak incidence of rejection (day 7) in order to be significant (1,12,13,17).
Elevation of total bilirubinemia and of relative and absolute eosinophilia have been proven to be predictors of ACR (6-10). Platelet destruction may be a marker of rejection; the extreme expression of this destruction is seen in ABO incompatible LT or in LT done in the preexistence of lymphocytotoxic antibodies. These four variables were combined in this study to form the BIO-score. Interfering medications as e.g. antivirals and blood products, were omitted during the first post-LT week in order to obtain a as "clean" as possible BIO-score.
This prospective single center study shows that their is a great discordance between the day 7 BA- and BIO-scores. The combination of Banff and biochemical scores may be a reliable marker for the clinician in order to define more precisely the real incidence of ACR but it is even more important to define the real incidence for treatment of rejection.
This simple "seven-up UCL scoring model" may be very valuable in judging new immunosuppressive drug studies and in selecting the candidates for complete IS withdrawal. We feel that the maximal interaction between donor and recipient immunological systems, (expressed, in this study, by a high Banff score (ł 6)) in the presence of an unmodified immunosuppressive treatment may be a most logical way to promote allograft tolerance (27). As a consequence of this study, IS is progressively withdrawn in those patients having presented the highest rejection scores without modification of immunosuppressive treatment.

References

  1. STARZL, T.E., DEMETRIS, A.J.: Liver transplantation. (1990) Year Book Med. Publ. Inc. Chicago
  2. STARZL, T.E., DEMETRIS, A.J., MURASE, N., ILDSTAD, S., RICORDI, C., TRUCCO, M. : Cell migration chimerism and graft acceptance. Lancet, 339, 1992: 1579-1582
  3. STARZL, T.E., DEMETRIS, A.J., TRUCCO, M., MURASE, N., RICORDI, C., ILDSTAD, S., RAMOS, H., TODO, S., TZAKIS, A., FUNG, J.J., NALESNIK, M., ZEEVI, A., RUBERT, W.A., KOCOVA, M. : Cell migration and chimerism after whole-organ transplantation : the basis of graft acceptance. Hepatology, 17, 1993: 1127-1152
  4. DEMETRIS, A.J., BATTS, K.P., DHILLON, A.P. and international panel.: Banff schema for grading liver allograft rejection : an international consensus document. J. Hepatology, 25, 1997: 658-663
  5. HUBSCHER, S. : Diagnosis and grading of liver allograft rejection : an European perspective. Transplant Proc.,28, 1996: 504-507
  6. FOSTER, P.F., SANKARY, H.N., HART, M., ASHMANN, M., WILLIAMS, J.W. : Blood and graft eosinophilia as predictors of rejection in human liver transplantation. Transplantation, 47, 1989: 72-74
  7. MANZARBEITA, C., RUSTGI, V.K., JONSSON, J., OYLOE, V.K. : Absolute peripheral blood eosinophilia : an early marker for rejection in clinical liver transplantation. Transplantation, 59, 1995: 1358-1360
  8. HUGHES, V.F., TRULL, A.K., JOSHI, O., ALEXANDER, G.J.M.: Monitoring eosinophil activation and liver function after liver transplantation. Transplantation, 65, 1998: 1334-1339
  9. NAGRAL, A., BEN-ARI, Z., DHILLON, A.P., BURROUGHS, A.K.: Eosinophils in acute cellular rejection in liver allografts. Liver Transplantation and Surgery, 4, 1998: 355-362
  10. TRULL, A., STEEL, L., CORNELISSEN, J., SMITH, T., SHARPLES, L., CARY, N., STEWART, S., LARGE, S., WALLWORK, J.: Association between blood eosinophil counts and acute cardiac and pulmonary allograft rejection. J Heart Lung Transplant, 17, 1998: 517-524
  11. LERUT, J., TALPE, S., ROGGEN, F., GHEERARDYN, R., CICCARELLI, O., LATERRE, P.F., OTTE, J.B., HOPE, J., BAZIN, H., GIANELLO, P., LATINNE, D.: One year results of Tacrolimus and anti-CD2a antibody (BTI-322) in adult liver transplantation. (2000), Proceedings International Transplantation Society - Congress - Rome
  12. DEMETRIS, A.J., QIAN, S., SUN, H., FUNG, J.J., YAGIHASHI, A., MURASE, N., IWAKI, Y., GAMBRELL, B., STARZL, T.E.: Early events in liver allograft rejection. Am. J. Pathol., 138, 1991: 609-618
  13. WIESNER, R.H., DEMETRIS, A.J., BELLE, S.H., SEABERG, E.C., LAKE, J.R., ZETTERMAN, R.K., EVERHART, J., DETRE, K.M.: Acute hepatic allograft rejection : incidence, risk factors and impact on outcome. Hepatology, 28, 1998: 638-645
  14. NEUBERGER, J., ADAMS, D.H.: What is the significance of acute liver allograft rejection ? J. Hepatol., 29, 1998: 143-150
  15. DOUSSET, B., CONTI, F., CHERRUAU, B., LOUVEL, B., SOUBRANE, O., HOUSSIN, D., CALMUS, Y.: Is acute rejection deleterious to long-term liver allograft function ? J. Hepatol., 29, 1998: 660-668
  16. McVICAR, J.P., KOWDLEY, K.V., BACCHI, C.E., BARR, D., MARSH, C.L., PERKINS, J.D., CARITHERS, R.L.: The natural history of untreated focal allograft rejection in liver transplant recipients. Liver Transplantation and Surgery, 2, 1996: 154-160
  17. SCHLITT, H.J., NASHAN, B., KRICK, P., RINGE, B., WITTEKIND, Ch., WONIGEIT, K., PICHLMAYER, R.: Intragraft immune events after human liver transplantation. Transplantation, 54, 1992: 273-278
  18. BELLI, L., DECARLIS, L., RONDINARA, G., ALBERTI, A., BELLATI, F., DEGASPERI, A., FORTI, D., IDEO, G.: Early cyclosporine monotherapy in liver transplantation : a 5-year follow-up of a prospective randomized trial. Hepatology, 27, 1998: 1524-1529
  19. TISONE, G., ANGELICO, M., PALMIERI, G., PISANI, F., ANSELMO, A., BAIOCCHI, L., NEGRINI, St., ORLANDO, G., VENNARECCI, G., CASCIANI, C.U.: A pilot study on the safety and effectiveness of immunosuppression without prednisone after liver transplantation. Transplantation, 10, 1999: 1308-1313
  20. LERUT, J., CICCARELLI, O., ROGGEN, F., LATERRE, P.F., GOFFETTE, P., DANSE, E., REDING, R., GEUBEL, A., REYNAERT, M.S., OTTE, J.B. (2001): Adult liver transplantation : the Université Catholique de Louvain Experience. Clinical Transplants, in press
  21. OPELZ, G.: Influence of treatment with cyclosporine; azathioprine and steroids on chronic allograft failure. Kidney Int., 48 1995: S89-92
  22. ROLLES, K., DAVIDSON, B.R., BURROUGHS, A.K.: A pilot study of immunosuppressive monotherapy in liver transplantation : Tacrolimus versus microemulsified cyclosporin. Transplantation, 68, 1999: 1195-1209
  23. PADBURY, R.T.A., GUNSON, B.K., DOUSSET, B., HUBSCHER, S.G., BUCKELS, J.A.C., NEUBERGER, J.M., ELIAS, E., McMASTER, P.: Steroid withdrawal from long-term immunosuppression in liver allograft recipients. Transplantation,55, 1993: 789-794
  24. MANEZ, R., KUSNE, S., LINDEN, P., GONZALES-PINTO, I., BONET, H., KRAMER, D., FUNG, J.J., STARZL, T.E.: Temporary withdrawal of immunosuppression for life-threatening infections after liver transplantation. Transplantation,57 1994: 148-164
  25. MAZARIEGOS, G.V., REYES, J., MARINO, I., DEMETRIS, A., FLYNN, B., IRISH, W., McMICHAEL, J., FUNG, J., STARZL, T.E.: Weaning of immunosuppression in liver transplantation recipients. Transplantation, 63, 1997: 243-249
  26. DEVLIN, J., DOHERTY, D., THOMSON, L., WONG, T., DONALDON, P., PORTMANN, B., WILLIAMS, R.: Defining the outcome of immunosuppression withdrawal after liver transplantation. Hepatology, 27, 1998: 926-933
  27. STARZL, T.E. and ZINKERNAGEL, R.M.: Antigen localization and migration in immunity and tolerance. N. Engl. J. Med., 339, 1998: 1905-1913.

Correspondence to :

Prof. Jan P. LERUT, MD, PhD
Department of Digestive Surgery
Cliniques Universitaires St-Luc / 1400
Université catholique de Louvain (UCL)
Av. Hippocrate 10
1200 Brussels - Belgium
Tel. : 00-32-2-764.53.06
Fax : 00-32-2-764.90.39
Email : Lerut @ ucl.chir.ac.be

Infekční zánět není jediným podnětem syntézy prokalcitoninu

Zazula R.1, Průcha M.2, Spálený A.1,
Jarešová M.3, Ryska M.4, Vítko Š.5

1Klinika anesteziologie , resuscitace a intenzivní péče, Institut klinické a experimentální medicíny Praha
přednosta: MUDr. Roman Zazula, Ph.D.
2Oddělení klinické biochemie, hematologie a imunologie, Nemocnice na Homolce, Praha
přednosta: prof. MUDr. Josef Hyánek, DrSc.
3Oddělení klinické imunologie, Institut klinické a experimentální medicíny Praha
přednosta: MUDr. Ilja Stříž, CSc.
4Klinika transplantační chirurgie, Institut klinické a experimentální medicíny Praha
přednosta: Doc. MUDr. Miroslav Ryska, Csc.
5Transplantcentrum, Institut klinické a experimentální medicíny Praha
přednosta: MUDr. Štefan Vítko

Souhrn

Prokalcitonin je považován za významný laboratorní parametr pro diferenciální diagnostiku zánětlivých komplikací - sepse, septického šoku a MODS. Jeho syntéza je indukována těžkými bakteriálními, mykotickými a parazitárními infekcemi.
Nespecifické zvýšení sérových koncentrací PCT je pozorováno po velkých operačních výkonech, těžkých traumatech a po podání některých imunosupresivních látek. Práce porovnává sérové koncentrace prokalcitoninu a CRP v perioperačním období u pacientů, kterým byla transplantována játra a tito pacienti neměli žádné známky infekčních komplikací. Skupiny pacientů jsou rozděleny podle druhu podávané imunosupresivní léčby. V 1. skupině 21 pacientů byla peroperačně podána polyklonální protilátka proti T lymfocytům (ATG- Fresenius) a metylprednisolon, ve druhé skupině 7. pacientů jen metylprednisolon. PCT bylo měřeno u příjemců jater před úvodem do celkové anestezie, ve 4. a 8. hodině po reperfuzi štěpu a denně do 4. pooperačního dne. Koncentrace PCT v séru byla měřena chemiluminiscenční metodou - kit LUMItest, Brahms. Diagnostica, Germany. Sérové koncentrace PCT byly zvýšené (max. 14 ng/ml) u pacientů po transplantaci jater bez ATG terapie. Velmi vysoké hodnoty PCT (až 249 ng/ml) byly naměřeny u pacientů, kterým ATG podán byl. Průměrná hodnota PCT u pacientů bez ATG terapie byla 45ng/ml a 59 ng/ml u pacientů, kterým byl ATG podán. Obě skupiny jsou navíc porovnány s 12 pacienty, kteří podstoupili resekci jater a u nichž sérová koncentrace PCT v průměru nepřesáhla 1,4 ng/ml. Výsledky této práce dokazují, že nejen infekční zánět je podnětem syntézy prokalcitoninu.
Klíčová slova: Prokalcitonin - Infekce - Sepse - Transplantace jater - Polyklonální protilátka ATG

Summary

Inflammatory is not only one stimulation for procalcitonin synthesis
Procalcitonin (PCT) levels increase in cases of systemic bacterial, fungal and protozoal infections, sepsis, septic shock and MODS. Non-specific elevation of PCT concentrations may occur after major surgeries or multiple traumas. Elevated concentrations of PCT were detected after administration of some immunosuppressive drugs.
The aim of our study was to compare PCT and CRP serum levels in patients after liver transplantations without any complications. PCT and CRP serum levels were measured in patients after liver transplantations with and without administration of anti-thymocyte antibodies (ATG Fresenius). Serum samples from patients after liver (21 recipients with and 7 recipients without ATG therapy) transplantations were evaluated. PCT serum concentrations were measured in liver transplant recipients before induction of anesthesia, at hours 4 and 8 following graft reperfusion, and daily until post-operative day 4 and in patients after pancreas or simultaneous kidney-pancreas transplantation before induction of anesthesia, in time of graft reperfusion and daily until post-operative day 4.
PCT levels were evaluated using an immunoluminometric assay (ILMA) with a LUMItest PCT Kit (Brahms Diagnostics, Berlin,Germany) with monoclonal antibodies against calcitonin and katacalcin sequences, parts of PCT molecule. CRP levels were evaluated using an turbidimetric assay (Cobas-Mira).
PCT serum levels were slightly elevated (up to 14 ng/mL) in several patients after liver transplantation without ATG therapy. PCT was strongly induced in most cases in patients after liver transplantations with ATG administration (up to 249 ng/mL). The mean value of maximum PCT concentration was 5.5 ng/ml in patients after liver transplantation without ATG therapy and 59 ng/mL in patients with ATG therapy. In addition, both groups are compared with 12 patients undergoing liver resection, whose mean serum PCT levels did not exceed 1.4 ng/mL. The results of the study indicate that not only infectious inflammation is a stimulus for procalcitonin synthesis.
Keywords: Procalcitonin - Infection - Sepsis - Liver transplant patients - Pan-T-cell antibodies

Úvod

V první polovině 90. let se objevila možnost průkazu infekční etiologie systémové zánětlivé reakce organizmu pomocí měření nového parametru - prokalcitoninu. Role PCT jako ukazatele infekčního zánětu byla již opakovaně doložena a dnes je tento protein považován za senzitivní a specifický marker těžkého bakteriálního zánětu. Prokalcitonin (PCT) je protein o sekvenci 116 aminokyselin a je prohormonem kalcitoninu. Za fyziologických podmínek je kalcitonin secernován C buňkami štítné žlázy, kde je tvořen právě ze svého prekurzoru - prokalcitoninu. Dochází k tomu při specifické intracelulární proteolýze, kdy z prekurzorového peptidu - preprokalcitoninu složeného ze 141 aminokyselin (AK) se odštěpí N-terminální oblast prokalcitonin (57 AK), dále kalcitonin (32 AK) a katakalcin (21 AK).
V současné době je prokázáno, že hlavním místem syntézy PCT jsou makrofágy a monocytární buňky různých orgánů, zejména jater (1). Vedle toho se však při jeho syntéze mohou uplatňovat další buněčné substráty - leukocyty (2) nebo neurokrinní buňky plic a střeva (3). V lidských monocytárních buňkách periferní krve bylo při použití polymerázové řetězové reakce prokázána mRNA indukovaného prokalcitoninu. Zda-li tyto buňky jako jediné jsou producentem PCT indukovaného u septických pacientů, není dosud přesvědčivě dokázáno.
U zdravých jedinců je PCT v plazmě pod hranicí detekovatelnosti a jeho syntéza je indukována těžkými bakteriálními, mykotickými a parazitárními infekcemi. Lokálně omezené nebo na orgán vázané infekce a opouzdřené abscesy indukují pouze mírné zvýšení prokalcitoninu (4).
Normální koncentrace PCT v plazmě i séru nepřekračuje 0,5 ng/ml. Všechny hodnoty vyšší jsou považovány za patologické. Pokud je koncentrace mezi 0,5 -2,0 ng/ml, je považována za mírně zvýšenou, nad 5 ng/ml jde o hodnotu výrazně zvýšenou. Panuje obecná shoda, že hodnoty PCT nad 10 ng/ml jasně indikují těžkou sepsi nebo septický šok.
Výjimkou jsou pacienti s transplantací jater, u kterých v časném pooperačním období dochází k výrazné elevaci PCT, aniž by byly přítomny známky infekce (5,6,7).

Cíl práce

Vyšetření sérových koncentrací PCT a CRP v perioperačním období u pacientů s transplantací jater.

Materiál a metodika

U dvou skupin pacientů podstupujících transplantaci jater byly v perioperačním období vyšetřeny sérové koncentrace PCT a CRP. Skupiny se vzájemně liší protokolem imunosupresivní léčby. V 1. skupině 21 pacientů byla v průběhu anhepatické fáze podána polyklonální protilátka proti T-lymfocytům - antithymocytární globulin (ATG-Fresenius) a metylprednisolon, poté pokračováno v kombinaci ATG, cyklosporin A a metylprednisolon. Ve 2. skupině 7 pacientů byl peroperačně podán pouze metylprednisolon a následná léčba byla vedena kombinací metylprednisolon a FK 506. U pacientů obou skupin nebyl pooperační průběh komplikován infekcí. Sérová koncentrace PCT a CRP byla měřena před úvodem do anestezie, ve 4. a 8. hodině po reperfuzi jaterního štěpu a dále denně do 4. pooperačního dne. Třetí porovnávací skupinu tvořilo 12 pacientů s resekcí jater bez infekčních komplikací v časném pooperačním období. Koncentrace PCT a CRP byla měřena před úvodem do anestezie, na konci operačního výkonu a denně do 4. pooperačního dne. Hodnoceny byly změny koncentrací PCT a CRP v perioperačním období v jednotlivých skupinách pacientů i rozdíly ve skupinách mezi sebou. Dále bylo testováno, zda sérové koncentrace PCT a CRP v 1. pooperačním dnu po transplantaci jater korelují s časem trvání studené ischemie jaterního štěpu a délkou manipulačního času (doba od vynětí orgánu z ledové tříště po reperfuzi). Koncentrace PCT v séru byla měřena chemiluminiscenční metodou - kit LUMItest, Brahms Diagnostica, Germany. Princip metody spočívá v přítomnosti monoklonálních protilátek proti sekvencím kalcitoninu a katakalcinu, z nichž jedna je luminiscenčně značena a druhou je potažena vnitřní stěna zkumavky. Během inkubace obě protilátky reagují s molekulami prokalcitoninu ve vzorku a množství vyvázaného komplexu na stěně zkumavky se kvantifikuje změřením luminiscenčního signálu. CRP byl měřen turbidimetricky na analyzátoru Cobas-Mira.

Statistické hodnocení

Při prezentaci výsledků je použito metody popisné statistiky (průměr, směrodatná odchylka, střední chyba průměru, rozpětí). Pro testování hypotéz je užito dvoustranných testů na 5% hladině významnosti.
Skupiny byly hodnoceny klasickou analýzou rozptylu (ANOVA) po logaritmické transformaci veličin. Pro srovnání jednotlivých dvojic skupin byla použita Schéffeho metoda.
Závislost mezi měřenými veličinami je hodnocena Spearmannovou pořadovou korelací.

Výsledky

Ve skupině pacientů s transplantací jater (OLTx) a s podáním ATG - dochází k signifikantnímu zvýšení sérové koncentrace PCT již ve 4. hodině po reperfuzi jaterního štěpu (17,06 ± 2,84 ng/ml) s maximem v 1. pooperačním dnu (59,08 ± 12,30 ng/ml) . V následujících dnech koncentrace PCT postupně klesají.
Ve skupině pacientů bez podání ATG - dochází k signifikantnímu zvýšení sérové koncentrace PCT také ve 4. hodině po reperfuzi štěpu (2,28 ± 0,46 ng/ml) s maximem v 8.hodině po reperfuzi (4,52 ± 1,24 ng/ml), od které koncentrace postupně klesají. Naměřené hodnoty jsou až desetinásobně nižší než hodnoty ve skupině první. Ve třetí skupině pacientů s resekcí jater dochází k lehké, ale signifikantní elevaci PCT v 1. pooperačním dnu na hodnotu 1,00 ± 0,23ng/ml a ještě mírnému navýšení ve druhém pooperačním dnu (1,41 ± 0,28 ng/ml), poté hodnoty v následujících dvou dnech klesají.
Koncentrace CRP ve skupině pacientů transplantovaných s podáním ATG se významně zvýšila ve 4. hodině po reperfuzi štěpu (22,64 ± 3,16 mg/l), nejvyšší zvýšení bylo v prvním pooperačním dnu (83,70 ± 10,39 mg/l) s poklesem v následujících dnech. Ve skupině OLTx bez podání ATG jsme zaznamenali signifikantní zvýšení koncentrace CRP v 1. pooperačním dnu (80,21 ± 13,55 mg/l) a následným poklesem. U pacientů s resekcí jater byla nejvyšší hodnota CRP zaznamenána ve druhém pooperačním dnu (57,27 ± 11,99 mg/l) s následným poklesem do 4. pooperačního dne.
Při hodnocení koncentrací PCT a CRP v jednotlivých skupinách mezi sebou bylo zjištěno, že v případě PCT se skupina pacientů OLTx s podáním ATG významně lišila od skupiny transplantovaných pacientů bez podání ATG, a to již od 4. hodiny po reperfuzi jaterního štěpu na hladině významnosti p<0,001. Koncentrace PCT u obou těchto skupin se významně lišila od skupiny pacientů s resekcí jater, ve které nejvyšší hodnota sérových koncentrace PCT byla 2,46ng/ml , v průměru pak 1,41 ng/ml (tab. č.1, graf č. 1 a 3).

Tab. č. 1 - Sérové hladiny PCT a CRP u pacientů s transplantací jater a resekcí jater

OLTx s ATG
(x ± s.e.)
n=21
před úvodem
do anest.
4 hod po
rep. štěpu
8 hod po
rep. štěpu
1. poop.
den
2. poop.
den
3. poop.
den
4. poop.
den
PCT (ng/ml) 0,40 ± 0,06 17,06 ± 2,91 54,76± 11,67 59,08 ± 12,60 45,05 ± 10,91 23,53 ± 5,15 9,89 ± 1,55
CRP (mg/l) 13,76 ± 3,22 22,64 ± 3,24 37,50 ± 6,44 83,70 ± 10,64 64,59 ± 7,93 34,83 ± 5,23 23,17 ± 5,00

OLTx bez ATG
(x ± s.e.)
n=7
před úvodem
do anest.
4 hod po
rep. štěpu
8 hod po
rep. štěpu
1. poop.
den
2. poop.
den
3. poop.
den
4. poop.
den
PCT (ng/ml) 0,37 ± 0,14 2,28 ± 0,50 4,52 ± 1,24 4,49 ± 1,63 2,84 ± 1,08 1,59 ± 0,51 1,18 ± 0,34
CRP (mg/l) 10,99 ± 4,37 32,06 ± 10,36 60,25± 10,31 80,21 ± 14,66 49,26 ± 8,80 29,33 ± 5,83 26,66 ± 6,57

Resekce jater
(x ± s.e.)
n=12
před úvodem
do anest.
0 poop. den 1. poop. den 2. poop.
den
3. poop.
den
4. poop.
den
PCT (ng/ml) 0,28 ± 0,05 0,29 ± 0,06 1,00 ± 0,24 1,41 ± 0,29 1,09 ± 0,25 0,65 ± 0,13
CRP (mg/l) 6,68 ± 2,36 5,96 ± 1,84 35,81 ± 7,07 57,27 ± 13,12 56,71 ± 15,23 44,73 ± 13,29

Graf č. 1 - Porovnání sérových hladin PCT u pacientů s OLTx s podáním ATG a bez podání ATG

Graf č. 2 - Porovnání sérových hladin CRP u pacientů s OLTx s podáním ATG a bez podání ATG

Graf č. 3 - Porovnání sérových hladin PCT u pacientů s OLTx s podáním ATG, s OLTx bez podání ATG a s resekcí jater

Graf č. 4 - Porovnání sérových hladin CRP u pacientů s OLTx s podáním ATG, s OLTx bez podání ATG a s resekcí jater

Koncentrace CRP nevykazovala významný rozdíl mezi jednotlivými skupinami (graf č. 2 a 4).
Ve skupině OLTx s ATG není signifikantní korelace mezi měřenými veličinami a dobou trvání studené ischemie a manipulačním časem. Ve skupině OLTx bez ATG koreluje hodnota sérové hladiny PCT v 1. pooperačním dnu s časem trvání studené ischemie (R=0,7857, p<0,05).

Diskuse

Prokalcitonin se jeví velice nadějným specifickým a senzitivním parametrem pro průkaz infekční etiologie při syndromu sepse. Jeho role je však stále provázena řadou nejasností. Týká se to zejména místa syntézy a fyziologické úlohy prokalcitoninu, což dosud není spolehlivě objasněno.
Rozdíly v dynamice tvorby PCT a CRP u pacientů s transplantací jater podáním ATG odporují hypotéze, že tyto proteiny podléhají podobným regulačním mechanizmům. Vzhledem k výrazné pooperační indukci PCT u osob, kterým byl podáván ATG, můžeme usuzovat, že tato polyklonální protilátka spolu s operačním traumatem či ischemií štěpu může být spouštěcím stimulem tvorby prokalcitoninu. Mechanizmus indukce PCT vlivem polyklonální protilátky proti membránovým antigenům T- lymfocytů (ATG je vyroben imunizací králíků buněčnou linií lidských T-lymfocytů Jurkat) zatím nebyl objasněn. Jednou z možností je vazba protilátky na některý epitop indukovaný při ischemii štěpu a následná aktivace buňky touto vazebnou interakcí. Nelze vyloučit, že tímto terčovým epitopem je některá z adhezivních molekul, např. ICAM-1 (CD54). O této molekule je známo, že může být indukována ischemickým poškozením štěpu a zároveň patří mezi cílové struktury ATG (buněčná linie Jurkat ji exprimuje ve značné míře). Podání polyklonální protilátky ATG (obsahující protilátky proti ICAM-1) může tak být začátkem alternativní cesty uvolnění prokalcitoninu.
S vysokou pravděpodobností se v tomto případě uplatňují odlišné regulační mechanizmy cytokinové sítě pro tvorbu PCT než v případě indukce endotoxinem, neboť zánětlivá reakce u těchto pacientů s velmi vysokými sérovými hladinami PCT není klinicky vyjádřena, jako je tomu u pacientů v sepsi a septickém šoku.

Závěr

Transplantace jater je již ve čtvrté hodině po reperfuzi jaterního štěpu provázena signifikantním zvýšením sérových hladin prokalcitoninu s maximem v prvním pooperačním dnu a rychlým poklesem do čtvrtého pooperačního dne. Přitom ve skupině pacientů, kterým je podána indukční imunosuprese polyklonální protilátkou ATG Fresenius, jsou průměrné hodnoty o řád vyšší (59,08l ± 12,60 ng/ml) proti skupině bez ATG (4,49 ± 1,63 ng/ml) p<0,001. Hodnoty CRP jsou od prvního pooperačního dne signifikantně zvýšené s následným poklesem, ale mezi skupinami není signifikantní rozdíl. Vysoké hodnoty sérových hladin PCT nejsou u pacientů provázeny klinickými známkami těžké systémové zánětlivé reakce. Není korelace mezi nejvyššími hladinami prokalcitoninu i CRP a dobou trvání studené ischemie jaterního štěpu ani délkou manipulačního času. U pacientů, kteří podstoupili resekci jater a tento výkon nebyl provázen komplikující infekcí, byly sérové koncentrace PCT zvýšeny jen mírně (1,41± 0,28 ng/ml).
Výsledky práce potvrzují, že regulační mechanizmy syntézy PCT a CRP nejsou s vysokou pravděpodobností totožné a dokazují, že nejen infekční zánět je podnětem syntézy prokalcitoninu.

Literatura

  1. Bracq, S., Machason, M.: Calcitonin gene expression in normal human liver. FEBS, 331, 1993:14-18
  2. Oberhoffer, M., Vogelsang, H., Jager, L. et al.: Katacalcin a calcitonin immunoreactivity in different types of leukocytes indicates intracelllular procalcitonin content. J.Crit.Care,14,1999:29-33
  3. Nylen, E., Snider, R., Thompson, K.A. et al.: Pneumonitis associated hyperprocalcitonemia. Am. J.Med. Sci.,312,1996: 12-18
  4. Brunkhorst, F.M., Wegscheider, K., Forycki, Z.F. et al.: Procalcitonin for early diagnosis and differentiation of SIRS, sepsis, severe sepsis, and septic shock. Intensive Care Medicine, 2000, Suppl.2, 148-152
  5. Kunz, D., Pross, M., König, W. et al.: Diagnostic relevance of procalcitonin, IL-6 and Cellular immune status in the early phase after liver transplantation. In: Transplantation Proceedings, 30,1998: 2398-2399
  6. Kuse, E.R., Langefeld, I., Jaeger, K. et al.: Procalcitonin - a new diagnostic tool in complications following liver transplantation. In: Intensive Care Med.,26, 2000: 187-192
  7. Zazula, R., Průcha, M., Tyll T., Spálený A., Černá M., Ryska M.: Sérové hladiny prokalcitoninu u pacientů s transplantací jater. Novinky v anesteziologii, intenzivní medicíně a léčbě bolesti, Galén, Praha , 2000: 274
  8. Sabat, R., Hoflich, C., Docke, D,W. et al.: Massive elevation of procalcitonin plasma levels in the absence of infection in kidney transplant patients treated with pan-T-cell antibodies. Int. Care Med., 27,2001: 987-991
  9. Nylen, E.S., Kevin, T., Whang, J. et al.: Mortality is increased by procalcitonin and decreased by an antiserum reactive to procalcitonin in experimental sepsis. Crit. Care Med., 26, 1998:1001-1006
  10. Nijsten, M.W.N., Nijsten- Olinga, P., Hauw, T. et al.: Procalcitonin behaves as a fast responding acute phase protein in vivo and in vitro. Crit. Care Med.,28, 2000:458-461.

Adresa pro korespondenci:

MUDr. Roman Zazula, Ph.D.
Klinika anesteziologie, resuscitace a intenzivní péče
IKEM
Vídeňská 1958/9
140 21 Praha 4 Krč

Současné možnosti perfúze jater a její význam pro jaterní přenosy

Kočík, M., Ryska, M., Bělina, F.

Klinika transplantační chirurgie
Institut klinické a experimentální chirurgie Praha
přednosta: Doc.MUDr. Miroslav Ryska, CSc.

Metodika perfuze a složení perfuzního roztoku ze značné míry ovlivňují úspěch orgánových transplantací. Cílem perfuze a následného uložení štěpu je zajistit obnovení jeho funkce po implantaci u příjemce okamžitě a v původní kvalitě. V tomto sdělení jsou shrnuty procesy při perfuzi štěpu, jeho studenené ischemii a reperfuzi, které podmiňují základní vlastnosti používaných perfuzních roztoků, metodiku perfuze a konzervace jaterního štěpu.
Odběrem každého orgánu dochází k přerušení zásobení kyslíkem - k ischemii. Buňky v normálních poměrech získávají energii k udržení své integrity oxidativní fosforylací, redukcí kyslíku na vodu v mitochondriích, při které je tvořena ATP. Při nedostatku kyslíku je tento proces limitován a dochází k velmi rychlé depleci ATP a tím poruchou na ATP závislých homeostatických intracelulárních mechanizmů až k letálnímu poškození buněk. Proto jako základu k uchovávání štěpů je využívána hypotermie, která oddaluje nástup ireverzibilního poškození tkání zpomalením reakčních rychlostí enzymů a tím zpomalením celého buněčného metabolizmu - při teplotě 4° C klesá pod 5 % původní aktivity (1). Zmrazení orgánů na teploty pod 0o C s sebou nese přeměnu vody na krystaly ledu, které působí nevratné poškození tkání. Pro praktické využití je tedy nejvhodnější teplota tajícího ledu, asi 0 - 4o C (2).
Samotná hypotermie má však na buňky též negativní vlivy. Jedním z hlavních je porucha iontové rovnováhy. Zpomalení funkce Na+/K+- ATPázy vede ke snížení membránového potenciálu a vstupu Cl- do buňky podle koncentračního gradientu. Ionty Cl- jsou následovány kationty a vodou a tak vznikající intracelulární edém může vést až k destrukci buňky (3).
Řada studií spojuje změny v intracelulární koncentraci Ca2+ s biochemickými změnami a histologickým poškozením vedoucím až k buněčné smrti. Deplece ATP inhibuje ATP - dependentní pumpy přenášející Ca2+ z buňky a do buněčných organel. Hypotermie mění fluiditu membrán, která spolu s edémem přispívá k abnormálnímu pohybu Ca2+ iontů (4).
Při studené ischemii štěpu se uplatňují i další děje. Anaerobní glykolýza, jako jediná možnost obnovy ATP, s následnou akumulací laktátu přispívá ke vzniku intracelulármí acidózy. Při ischemii dochází ke konverzi xantindehydrogenázy na xantinoxidázu. Při degradaci ATP nahromaděný hypoxantin je za normálních podmínek metabolizován xantindehydrogenázou na xantin s využitím NAD (5). Xantinoxidáza využívá při metabolizaci hypoxantinu jako substrát místo NAD kyslík za tvorby velkého množství superoxidového aniontu.
Někteří autoři ukazují maximum poškození jaterního štěpu ve výstelce sinusoid podmíněných hypotermií oproti mikrocirkulaci jiných orgánů a mluví tak o specifických změnách pro játra (3). Ke změnám způsobeným ischemií - hypotermií se při nevhodném výběru perfuzního roztoku (nízká onkotická nálož) přidává i edém intersticiálního prostoru, který způsobuje kompresi kapilárního systému a tím nedokonalou distribuci tohoto perfuzního roztoku (6).
Mnoho změn vzniklých v době studené ischemie štěpu se manifestuje časně po reperfuzi během implantace. Metabolické účinky xantinoxidázy, která pro svoji činnost potřebuje kyslík a kterého je po reperfuzi opět dostatek, se projeví zvýšenou tvorbou volných kyslíkových radikálů. Tyto velmi reaktivní molekuly poškozují buňky zejména denaturací enzymatických a strukturálních proteinů, destrukcí nukleových kyselin a peroxidací polynenasycených mastných kyselin membrán (7). Poškození výstelky sinusoid podmiňuje adhezi leukocytů s dezintegrací endotelu a vznikem intersticiálního edému. Leukocyty teoreticky mohou obstrukcí sinusoid způsobit až "no-reflow" fenomén (8). Důležitější je však pravděpodobně jejich produkce cytokinů a proteáz poškozujících buňky přímo nebo přes další procesy. Například tvorba eikosanoidů ovlivňuje aktivaci Kupfferových buněk - tromboxany, prostaglandin D2 a leukotrieny podporují další adhezi leukocytů a prostaglandin D2 by mohl být významným mediátorem při zhoršené produkci žluči (9). Aktivace Kupfferových buněk je spojována se zhoršenou funkcí štěpu (8). Aktivace destiček až se vznikem prokoagulačního stavu (3).

Technika perfuze jater

Techniky perfuze byly vyvinuty dvě. Kontinuální strojem řízená perfuze orgánu hypotermickým okysličeným roztokem se zdála být vhodným řešením výše uvedených problémů, neboť štěp stále funguje aerobně a jsou odplavovány nežádoucí produkty metabolizmu. Do širšího klinického použití se tato metoda neprosadila hlavně z technických důvodů. Je třeba drahé přístrojové vybavení, jsou problémy při transportu a metoda je velmi finančně náročná. Navíc konkrétní výsledky perfuze jater byly spíše zklamáním kvůli značnému poškození endotelu a Kupfferových buněk (6). Tato metoda je využívána v několika centrech v USA s velmi dobrými výsledky u transplantace ledvin (10). V současné době je k této technice opět obracena pozornost vzhledem k možnosti rozšíření poolu dárců o marginální jaterní štěpy.
Nejvíce používána je metoda prosté "gravitační" perfuze chladným konzervačním roztokem s následným uskladněním v témže roztoku. Během vývoje byla testována celá řada těchto roztoků. Obecného klinického použití se dočkaly pouze následující:
Euro - Collins (EC)
roztok University of Wisconsin (UW)
histidin-tryptofan-ketoglutarátový roztok Bretschneiderův (HTK).

K nim se připojuje nově vyvinutý roztok Celsior, který nyní prochází prvními klinickými testy. Složení roztoků je uvedeno v tabulce.
Tabulka č. 1- Složení perfuzních roztoků
  EC UW HTK Celsior
glukóza 140 - - -
laktobionát - 100 - 88
rafinóza - 30 - -
manitol - - 30 60
glutamát - - - 20
ketoglutarát - - 1 -
tryptofan - - 2 -
fosfátový pufr 57,5 25 - -
sulfátový pufr 30 5 - -
histidinový pufr - - 198 30
glutathion - 3 - 3
alopurinol - 1 - -
adenosin - 5 - -
hydroxyetylškrob - 50 g/l - -
Na 10 30 15 100
K 115 125 9 15
Cl - - 40 28,25
Ca - - - 0,25
Mg - 5 4 13
další: inzulin
penicilin
dexametason
-
-
-
100 j./l
40 j./l
8
-
-
-
-
-
-
osmolarita 406 320 310 360

(Hodnoty v tabulce uvedeny v mmol/l pokud není uvedeno jinak.)

Experimentálně jsou zkoušeny různé obměny metod perfuze. Zejména se týkají oxygenace štěpu během konzervace. Například venózní persuflace štěpu hypotermicky uloženého v UW roztoku prokázala na prasečím modelu zlepšení potransplantační funkce u "non heart beating" dárců (11).
Podrobnější poznání poškození spojeného s reperfuzí vedlo k myšlence "vypláchnutí" štěpu těsně před ní s cílem odplavení nahromaděných toxických metabolitů a substrátů. Byl vytvořen speciální roztok - Carolina rinse solution, který obsahuje antioxidanty, scavengery volných kyslíkových radikálů, kalciové blokátory a fruktózu s glukózou a inzulínem pro zlepšení postischemického energetického stavu buněk. Experimenty na krysách (12) a prasatech prokázaly určité výhody tohoto roztoku. Použití při klinických transplantacích ukázalo pouze mírně nižší hodnoty bilirubinu a jaterních enzymů v časném pooperačním období (2).

Roztok Euro-Collins (EC)

Jako první roztok umožňující uchovat ledviny v dostatečné kvalitě po 20 hodin byl roztok vyvinutý Collinsem na konci 60. let (1). Hlavní součástí je koncentrovaná glukóza bránící vzniku buněčného edému a fosfátový a bikarbonátový pufr. Iontové složení je přizpůsobeno intracelulárnímu prostředí za účelem zabránění úniku K+ z buňky během konzervace. Pro transplantaci jater použil tento roztok poprvé Starzl v roce 1977 s uspokojivými výsledky po 6 až 9 hodinách studené ischemie. Do konce 80. let došlo pouze k malým změnám ve složení. Eurotransplant odstranil ionty Mg2+ bez negativního vlivu na výsledky - roztok Euro-Collins (13). EC byl poměrně levný a jednoduchý roztok, který se stal standardem pro 70. a 80. léta. Nevýhodou bylo jednak nutnost sterilizovat roztok glukózy odděleně od elektrolytové části a jejich smíchání těsně před použitím, hlavně však užití této hypertonické glukózy jako nositele osmotické nálože. V jaterních buňkách, které jsou oproti ledvinám pro glukózu volně prostupné, je za hypotermických podmínek glukóza metabolizována na laktát a tak přispívá ke zvětšení počtu intracelulárních molekul a tím ke vzniku buněčného edému. Proto byla vyvíjena řada roztoků, kde glukóza byla nahrazována manitolem (Sacksův roztok), citrátem (Marshallův roztok) a dalšími komponentami. Žádný z nich však nedospěl k širšímu klinickému použití.

Roztok University of Wisconsin (UW)

Z výsledků výzkumu ischemického a perfuzně-reperfuzního poškození jaterního štěpu popsal Belzer základní vlastnosti složek konzervačních roztoků (6). Měly by minimalizovat buněčný edém, účinně zamezovat vzniku intracelulární acidózy, bránit expanzi intersticiálního prostoru, poškození volnými kyslíkovými radikály (hlavně během reperfuze štěpu) a poskytovat substráty pro regeneraci vysokoenergetických fosfátů. Výsledkem byl vývoj nového konzervačního roztoku - University of Wisconsin, který byl původně zamýšlen pro uchovávání pankreatu (1). Zásadní změnou bylo užití inertních substrátů laktobionátu a rafinózy k udržení osmotické koncentrace místo metabolicky aktivní glukózy a přidání ještě dalšího koloidu hydroxyetylškrobu. Jako scavenger volných kyslíkových radikálů byl přidán glutathion. Alopurinol jako inhibitor xantinoxidázy snižuje jejich tvorbu. Byly popsány i další vlastnosti jednotlivých složek. Adenosin kromě stimulace syntézy ATP působí down-regulačně na Kupfferovy buňky, jako inhibitor trombocytů, inhibuje tvorbu O2- neutrofily receptorovým mechanizmem a působí vasodilatačně (3). Manitol a hydroxyetylškrob mohou působit jako scavangery O2- (7). Fosfát jako pufr a stimulátor ATP syntézy a Mg2+ jako kofaktor enzymů a membránový stabilizátor (14).
V experimentech na zvířatech bylo dosaženo lepších výsledků oproti EC při studené ischemii již přesahující 2 hodiny (15). Na krysím modelu bylo jasně prokázáno snížení hladin ALT, AST a bilirubinu a zvýšení produkce žluči po transplantaci při perfuzi a uložení štěpu v UW roztoku (15, 16, 17). Prokázáno bylo též zlepšení procenta přežívání při srovnatelných časech ischemie i značné prodloužení její maximální doby, kdy je možné játra ještě úspěšně transplantovat, i nižší poškození hodnocené histologicky (16, 18, 19). Klinické zkoušky na sebe nenechaly dlouho čekat s výsledky obdobnými experimentálním. Bylo dosaženo lepších výsledků při uchování jater do 24 hodin v UW než po 5 hodinách v EC (20). Nicméně i při konzervaci UW roztokem byly prokázány rozdíly v pooperační funkci štěpu s délkou studené ischemie pod a nad 12 hodin (21).
Celkově proti Euro-Collinsu zlepšení nastalo jak v pooperačních hladinách jaterních enzymů, tak ve snížení množství aplikovaných krevních derivátů, snížení četnosti primární afunkce i dysfunkce štěpu, výskytu trombózy hepatální arterie, počtu retransplantací, kratším pobytu na jednotkách intenzivní péče i kratší celkové době hospitalizace a tím i snížení nákladů (22, 23).
Nevýhod UW je několik. Především je to vysoký obsah K+, který při reperfuzi může způsobit bradykardii až asystolii příjemce, a proto je nutné před revaskularizací štěpu provést jeho výplach roztokem například Ringer-laktátu nebo je nutné prvních asi 200 - 300 ml reperfundované krve vypustit přes infrahepatickou kavální anastomosu před otevřením suprahepatické vena cava inferior. Další nevýhodou UW je jeho poměrně vysoká viskozita, která při velkém odporu jaterních arterií může způsobit nedostatečnou perfuzi sinusoid a kapilár žlučových cest (může být důvodem zdánlivě vyššího výskytu biliárních komplikací po skladování jater déle než 12 hodin (1)).
Vzhledem k vysoké ceně UW se řada experimentů zaměřovala též na možnost perfuze jater dárce jeho kombinací s jiným známým levnějším roztokem. Přes špatné výsledky pokusů na zvířatech byla v Dallasu provedena studie s kombinací perfuze EC in situ před explantací a UW roztokem po explantaci na back-table, která ukázala srovnatelnou funkci štěpu po transplantaci s případem, kdy obě perfuze byly provedeny UW, nicméně s odhadovaným snížením nákladů na jeden odběr asi o 400 - 1200 USD (24). Další studie ukázala zmenšení intraoperačních krevních ztrát a zlepšení histologického nálezu implantátu po perfuzi EC přes aortu a UW přes vena portae (25). Přesto se UW roztok sám o sobě stal novým standardem pro ukládání nejen jater, ale i ostatních intraabdominálních orgánů.
Experimentálně byla zkoušena řada modifikací UW, které však přinesly pouze jednotlivé pozitivní výsledky a eventuální uvedení do klinické praxe vyžaduje dalších výzkumů. Například přidání kalciového blokátoru (4) či dodání redukovaného glutathionu těsně před perfuzí (2). Otočení poměru Na+/K+ nemá na výslednou funkci štěpu vliv (26).

Histidin-tryptofan-ketoglutarátový roztok (HTK)

HTK byl původně vyvinutý H. J. Bretschneiderem v Göttingen, SRN, jako fyziologický kardioplegický roztok (6). Základními vlastnostmi jsou nízký obsah K+, umožňující relativně bezpečnou reperfuzi, a užití vysoce účinného histidinového pufru a manitolu jako osmoticky aktivní látky. Jasnou výhodou oproti UW roztoku je jeho velmi nízká viskozita, která umožňuje optimální rozdělení účinných látek mezi různé orgánové kompartmenty (Bretschneiderův "equilibration" princip). Na prasečích játrech byl též prokázán lepší "výplachový" efekt HTK pro dárcovské erytrocyty než u UW (27). Při srovnávacích studiích HTK - UW na krysách nebyly při 4hodinovém uskladnění štěpů ve sledovaném médiu pozorovány žádné statisticky významné rozdíly ve funkci (hladiny ALT, AST a bilirubinu, produkce žluči) či krátkodobém přežití (17). Histologické porovnání však ukázalo ve skupině HTK menší intracelulární i intersticiální edém, tukovou degeneraci, méně intralobulárních nekróz a téměř úplnou absenci aktivace Kupfferových buněk(18). Při prodloužené době ischemie na 24, resp. 48 hodin jiné práce ukázaly zvětšení poškození jater a zhoršení přežití u HTK oproti UW (1, 28). Jako příčina se jeví horší schopnost HTK zabraňovat vzniku buněčného edému při dlouhých dobách konzervace, kdy manitol a histidin, pro které je při kratších dobách skladování štěpu buněčná membrána nepropustná, s narůstajícím časem začínají pronikat intracelulárně (1).
Následné klinické výzkumy výsledky experimentální v podstatě potvrdily. V několika německých centrech prokázali při dobách studené ischemie do 24 hodin srovnatelné výsledky při použití HTK i UW, co se týče primární afunkce štěpu, třicetiměsíčního přežití a pooperačních hladin jaterních testů (1, 13, 29). Pozorovány však byly u HTK nižší parametry cholestázy a nižší četnost nekróz žlučových cest (1).

Celsior

Tento poměrně nový roztok vyvinul Menasché a spolupracovníci v roce 1994 původně pro konzervaci myokardu (30). Spojuje v sobě výhody UW - obsahuje inertní nosiče osmotické nálože (laktobionát a manitol) s výhodami HTK - nízká viskozita, nízká kalémie a silná pufrovací kapacita (histidin). Dále je přidán glutamát jako substrát k regeneraci ATP a scavanger volných kyslíkových radikálů. Iontové složení připomíná extracelulární prostředí.
Pokusy s perfuzí jater na zvířatech nyní probíhají v řadě transplantačních center. Poslední dobou bylo publikováno několik prací, které ukázaly minimálně stejnou schopnost konzervace a uchování štěpu ve srovnání s UW i HTK (1, 30, 31, 32). Výsledky prvních klinických testů z Itálie, zatím pouze na malých souborech a pouze v třicetidenním pooperačním sledování neprokázaly oproti UW statisticky významné změny v klinických známkách i laboratorních údajích (33). Tyto údaje však mohou být modifikovány i tím, že zatím není známo ideální množství roztoku pro jaterní perfuzi.

Současný stav

Od roku 1963, kdy byla Starzlem provedena poprvé lidská transplantace jater, bylo jistě v celém tomto procesu dosaženo značného pokroku. Pro konzervační roztoky k uchování jater během studené ischemie toto platí též. V počátcích byla játra proplachována pouze fyziologickým roztokem s bezpečnou dobou studené ischemie méně než 4 hodiny (17). Zavedením EC se tato doba prodloužila na maximálně 10 hodin. K dalšímu zlepšení došlo až s nástupem UW a později též HTK s publikovanými maximy 34 resp. 24 hodin (1). V řadě souborů byly však při delších časech konzervace pozorovány horší výsledky (jaterní testy, produkce žluči, frekvence primární afunkce, nekrózy hepatocytů na rutinní biopsii po reperfuzi, počet nutných převodů krevních plazem pooperačně, jaterní mikrocirkulace, přežití pacientů a štěpu, počet retransplantací) u těch skupin pacientů, kde studená ischemie přesahovala 10 nebo 12 hodin (1, 17, 21, 34, 35). Proto nyní řada autorů doporučuje nepřekračovat v klinické praxi hranici 12 hodin. Obdobné údaje pro Celsior nejsou doposud k dispozici. Při desetihodinové konzervaci se však výsledky jeví jako srovnatelné s UW (33). Přes všechny úspěchy však stále platí, že studená ischemie představuje možnost potenciálního postižení orgánové funkce a v případě přítomnosti různých rizikových faktorů ze strany dárce (např. vyšší věk, steatóza) či příjemce (pacient v komatu, retransplantace) je třeba usilovat o její co největší zkrácení.
Prodloužení ischemické doby mělo též značný vliv na průběh transplantace jako celku. Umožnilo lepší přípravu dárce, provedení často značně náročné (např. pacient s cirhózou, po předchozích intraabdominálních operacích, značné krevní ztráty při špatných parametrech koagulace či velké portální hypertenzi) hepatektomie u příjemce bez časového stresu. Zlepšil se výběr vhodného příjemce s možností transportu štěpu na dlouhé vzdálenosti. Byl umožněn výběr ještě druhého kandidáta při nemožnosti provést úspěšně celou transplantaci u prvního zvoleného příjemce. Dále zmenšení jater či splitting a možnost oddělení jednotlivých orgánů při multiorgánovém odběru až po perfuzi ex situ na back-table. Usnadnila se i organizace, kdy častěji lze operaci na příjemci posunout z nočních hodin na ráno a tím do doby normálního provozu na odděleních i operačních sálech.
K výběru určitého konzervačního roztoku přispívá jistě též jeho cena. UW je značně dražší než HTK. Při dodržení objemů HTK původně publikovaných Bretschneiderem, které je asi 4 až 5x větší než u UW (přibližně 4l oproti 16 až 20 l), rozdíl v ceně není až tak zřejmý. Jiní ukazují, že toto množství HTK není vždy nutné, a použití kolem 10 l na multiorgánový odběr znamená již významné snížení nákladů (13). Pro Celsior, který je též cenově výhodnější než UW, zatím ideální perfuzní objemy nejsou známé.
Při multiorgánových odběrech zatím dle literárních údajů převládá používání UW. Jednak při transplantaci odebraných orgánů na jednom pracovišti lze předpokládat delší dobu ischemie a též jsou zatím menší zkušenosti s používáním HTK k uchovávání pankreatu a eventuálně i tenkého střeva. Je zde rozdíl i mezi USA, kde je tradičně požíván UW, a Evropou již s celou řadou center používajících HTK. Podle doposud provedených experimentů na zvířatech a prvních klinických prací se výsledky při použití Celsioru jeví jako nadějné u orgánů břišních i hrudních (30-33, 36, 37). Pro jeho využití při multiorgánových odběrech je však třeba dalších studií.

Literatura

  1. Drews, G., Spiegel, H. U.: Leberkonservierung - Rückblick und aktueller Stand. Jahrbuch der Chirurgie, 1999: 143-157
  2. Jamieson, N. V.: An Overview of Abdominal Organ Preservation for Transplantation. Organ preservation with HTK and UW solution, Pabst Science Publishers, Lengerich, 1999: 19-36
  3. Clavien, P. A., Harvey, P. R. C., Strasberg, S. M.: Preservation and Reperfusion Injuries in Liver Allografts. Transplantation 53, 1992: 957-978
  4. Blankensteijn, J. D., Terpstra, O. T.: Liver Preservation: The Past and the Future. Hepatology 13, 1991: 1235-1250
  5. Welbourn, C. R. B. et al.: Pathophysiology of ischaemia reperfusion injury: central role of the neutrophil. Br. J. Surg. 78, 1991: 651-655
  6. Belzer, F. O., Southard, J. H.: Principles of Solid - Organ Preservation by Cold Storage. Transplantation 45, 1988: 673-676
  7. Risby, T. H. et al.: Evidence for free radical - mediated lipid peroxidation at reperfusion of human orthotopic liver transplants. Surgery 115, 94: 94-101
  8. Menger, M. D., Vollmar B.: The role of microcirculation in organ preservation. Organ preservation with HTK and UW solution, Pabst Science Publishers, Lengerich, 1999: 37-46
  9. Post, S. et al.: Role of Eicosanoids in Reperfusion Injury in Rat Liver Transplantation. Transpl. Proc. 25, 1993: 2547
  10. D´Alessandro, A. M. D. et al.: Organ Preservation. Surg. Clin. of North Am. 74, 1994: 1083-1095
  11. Minor, T. et al.: Energy metabolism in organ preservation: Gaseous aerobiosis to improve viability of fresh and predamaged livers during hypothermic storage. Organ preservation with HTK and UW solution, Pabst Science Publishers, Lengerich, 1999: 47-60
  12. Wenshi, G. et al.: Carolina rinse solution - a new strategy to increase survival time after orthotopic liver transplantation in the rat. Transplantation 52, 1991: 417-424
  13. Mühlbacher, F., Langer, F., Mittermayer C.: Preservation Solutions for Transplantation. Transpl. Proc. 31, 1999: 2069-2070
  14. Southard, J. H.: Advances in Organ Preservation. Transpl. Proc. 21, 1989: 1195-1196
  15. Sankary, H. N., Foster, P., Brown, E., Hart, M., Williams, J. W.: A Comparison of Collins and UW Solutions for Cold Ischemic Preservation of the Rat Liver. J. of Surg. Res. 51, 1991: 87-91
  16. Adam, R., Settaf, A., Fabiani, B., Bonhomme, L., Astarcioglu, I., Lahlou, N. K., Bismuth, H.: Comparative Evaluation of Euro-Collins, UW Solution, and UW Solution Without Hydroxyethyl Starch in Orthotopic Liver Transplantation in the Rat. Transpl. Proc. 22, 1990:499-502
  17. Spiegel, H. U., Schleimer, K., Kranz, D., Oldhafer, K. J.: Organ Preservation with EC, HTK, and UW Solutions in Orthotopic Liver Transplantation in Syngeneic Rats. Part I: Functional Parameters. J. of Invest. Surg. 11, 1998: 49-56.
  18. Spiegel, H. U., Schleimer, K., Freise, H., Diller, R., Drews, G., Kranz, D.: Organ Preservation with EC, HTK, and UW Solutions in Orthotopic Liver Transplantation. Part II.: Morphological Study. J. of Invest. Surg. 12, 1999: 195-203
  19. Liu, T., Walsh, T. R., Nalesnik, M., Makowka, L.: Improved preservation of the rat liver for orthotopic liver transplantation: Use of University of Wisconsin - lactobionate solution and retrograde flushing. Surgery 108, 1989: 890-897
  20. Todo, S., Nery, J., Yanaga, K., Podesta, L., Gordon, R. D., Starzl, T. E.: Extended Preservation of Human Liver Grafts with UW Solution. JAMA 261, 1989: 711-714
  21. Adam, R., Bismuth, H., Diamond, T., Ducot, B., Morino, M., Astarcioglu, I., Johann, M., Azoulay, D., Chiche, L., Bao, Y. M., Castaing, D.: Effect of extended cold ischemia with UW solution on graft function after liver transplantation. Lancet 340, 1992: 1373-1376
  22. Cofer, J. B., Klintmalm, G. B., Howard, T. K., Morris, C. V., Husberg, B. S., Goldstein R. M., Gonwa, T. A.: A Comparison of UW with Eurocollins Preservation Solution in Liver Transplantation. Transplantation 46, 1990: 1088-1093
  23. D´Alessandro, A. M., Kalayoglu, M., Hoffmamm, R. M., Pirsch, J. D., Lorentzen, D. F., Melzer, J. S., Belzer F. O.: Experience With Belzer UW Cold Storage Solution in Human Liver Transplantation. Transpl. Proc. 22, 1990: 474-476
  24. Cofer, J. B., Klintmalm, G. B., Morris, C. V., Solomon H., Watemberg, I. A., Husberg, B. O., Jennings, L. W.: A Prospective Randomized Trial between Euro-Collins and University of Wisconsin Solutions as the Initial Flush in Hepatic Allograft Procurement. Transpl. 53, 1992: 995-998
  25. Adam, R., Astarcioglu, I., Raccula, J. S., Ducot, B., Reynes, M., Bismuth, H.: Benefitial Effects of Eurocollins as Aortic Flush for the Procurement of Human Livers. Transplantation 61, 1996: 705-709
  26. Abdennebi, H. B.: High - Na+ low - K+ UW cold storage solution reduces reperfusion injuries of the rat liver graft. Transpl. Int. 11, 1998: 223-230
  27. Aminalai, A., Kehrer, G., Großmann, F., Richter, J., Bretschneider, H. J.: Morphological investigation of the porcine liver directly following preservation with Euro-Collins, University of Wisconsin and Bretschneider´s HTK solution. Langenbecks Arch. Chir. 377, 1992: 81-88
  28. Van Gulik, T. M., Reinders, M. E., Nio, R., Frederiks, W. M., Bosma A., Klopper, P. J.: Preservation of Canine Liver Grafts Using HTK Solution. Transplantation 57, 1994: 167-171
  29. Erhard, J., Lange, R., Scherer, R., Kox, W. J., Bretschneider, H. J., Gebhard, M. M., Eigler, F. W.: Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate (HTK) solution versus University of Wisconsin (UW) solution for organ preservation in human liver transplantation. Transpl. Int. 7, 1994: 177-181
  30. Cascales, P., Fernandez-Cornejo, V., Sanchez-Del Campo, F., de Torre, M., Sanchez-Eixeres, M. R., Soriano, N., Gonzalez, F.: Evaluation of Celsior Solution in Experimental Liver Preservation Using Ex Situ Isolated Rat Liver Perfusion. Transpl. Proc. 31, 1999: 2437-2438
  31. Valero, R., Almenara, R., García-Valdecasas, J. C., Beltran, J., Net, M., Capdevila, L., López Boado, M. A., González, F. X., Taura, P., Visa, J., Manyalich, M.: Usefulness of Celsior in Graft Preservation of Livers Obtained from Non Heart Beating Donors in Experimental (Pigs) Liver Transplantation: Comparative Study with University of Wisconsin Solution. Transpl. Proc. 31, 1999: 2433-2434
  32. Tolba, R. H., Akbar, S., Müller, A., Glatzel, U., Minor, T.: Experimental Liver Preservation with Celsior: A Novel Alternative to University of Wisconsin and Histidine-Tryptophan-?-Ketoglutarate Solutions? Eur. Surg. Res. 32, 2000: 142-147
  33. Maggi, U., Caccamo, L., Gatti, S., Paone, G., Reggiani, P., Rossi, G., Latham, L., Vannelli, A., Melada, E., Brambilla, R., Damilano, I., Trezza, P., Fassati, L. R.: Celsior Solution and Clinical Liver Transplantation. Transpl. Proc. 32, 2000: 36-37
  34. Klar, E., Angalescu, M., Zapletal, C., Kraus, T., Bredt, M., Herfarth, C.: Definition of Maximum Cold Ischemia Time without Reduction of Graft Quality in Clinical Liver Transplantation. Transpl. Proc. 30, 1998: 3683-3685
  35. Kadmon, M., Bleyl, J., Küppers, B., Otto, G., Herfarth, C.: Biliary Complications After Prolonged University of Wisconsin Preservation of Liver Allografts. Transpl. Proc. 25, 1993: 1651-1652
  36. Baldan, N., Toffano,M., Cadrobbi, R., Codello, L., Calabrese, F., Bacelle, L., Rigotti, P.: Kidney Preservation in Pigs Using Celsior, a New Organ Preservation Solution. Transpl. Proc. 29, 1997: 3539-3540
  37. Barr, M. L., Nishanian G. P:, Sakamaki, Y., Carey, J. N., Chang, J:, Starnes, V. A.: A New Organ Preservation Solution, Celsior, Is Superior to Euro-Collins and University of Wisconsin Solutions in Decreasing Lung Reperfusion Injury. Transpl. Proc. 29, 1997: 1357-1358.

Adresa pro korespondenci:

MUDr. Matěj Kočík
Klinika transplantační chirurgie
IKEM
Vídeňská 1958/9
140 00 Praha 4

Transplantace segmentu tenkého střeva - experimentální model

Froněk, J., Kudla, M., Ryska, M.

Klinika transplantační chirurgie
Přednosta: Doc. MUDr. Miroslav Ryska, Csc.
Institut klinické a experimentální medicíny, Praha

Transplantace tenkého střeva (IT) byla jednou z prvních orgánových transplantací provedených v experimentu (1). Přesto bylo jen velmi málo výsledků publikováno ve srovnání s výsledky experimentálních transplantací ledviny, srdce a jater. Je to pochopitelné především proto, že tyto ostatní orgánové transplantace byly zavedeny na rozdíl od IT do klinické praxe, a to již v šedesátých a sedmdesátých letech (2). První klinické zkušenosti s IT byly natolik špatné, že na své znovuzavedení do klinické praxe si musela počkat až do roku 1987 (3).
Imunologické a technické problémy stále brání úspěchům v klinické praxi. Vhledem k těmto překážkám je souhra experimentální práce s klinickou praxí nezbytností. Část problémů se postupně daří řešit, jiné vznikají vzhledem k vývoji nových léků a léčebných postupů (4).
Zpočátku byly experimenty prováděny na prasatech, psech a ostatních zvířatech, která jsou obecně vhodná pro experimentální účely. V dnešní době je nejčastěji používaným zvířetem laboratorní krysa, a to z několika důvodů. Především pro svou cenu, mikrochirurgická operační technika na krysím modelu je poměrně dobře propracovaná, i v ostatních orgánových transplantacích je nejčastěji používaným experimentálním modelem. Zkušenosti s tímto modelem jsou mnohaleté a dobré (5).
Cílem této práce je seznámit odbornou veřejnost s modelem, který byl autory zaveden v IKEM. Tento model byl částečně během zavádění do experimentální praxe v IKEM modifikován. Dosud nebyl vyzkoušen model v celém svém rozsahu, autoři proto popisují prvou část, tedy odběr štěpu tenkého střeva u krysy, na základě vlastních zkušeností, druhou, tedy rekonstrukční část modelu, na základě prvních zkušeností a literárních podkladů.
Ve většině experimentálních prací, publikovaných ve světové literatuře, je experimentální model transplantace segmentu tenkého střeva u potkana tradičně označován za obtížný, bývá zatížen mnoha technickými problémy. IT v experimentu na kryse je nejpoužívanějším modelem, technika však není jednotná. Je používáno hned několik technik IT na krysím modelu, z čehož vyplývá, že ani jediný model není optimální. V zásadě jsou popisovány dva základní chirurgické modely IT na kryse, další modely jsou od těchto odvozené, jsou modifikovány podle účelu experimentu. První je implantace fetálního či novorozeneckého střeva jako "volného štěpu" do omenta dospělého příjemce. Druhým modelem je transplantace štěpu tenkého střeva dospělého dárce dospělému příjemci, a to buď heterotopicky, jako akcesorní štěp, s užitím cévních anastomóz, nebo ortotopicky s resekcí tenkého střeva příjemce (6). Tato druhá technika je ve svém provedení velmi rozmanitá. Cévní anastomózy lze šít ručně, lze je též provádět s pomocí "cuff" techniky, tedy s pomocí polyetylenových trubiček, kterými je provedena anastomóza. Žilní anastomóza, tedy v. portae, je našívána většinou na v. cava inf., tepna, tedy a. mesenterica superior, je našívána na aortu, a to buď přímo, nebo se štěpem aorty dárce. Neexistuje univerzální technika, která by byla uznávána a používána všemi centry. Pokud lze podle literatury soudit, je na tom kterém pracovišti používána taková technika, se kterou má toto pracoviště nejdelší a tedy nejlepší zkušenosti. Z literatury dále vyplývá, že i ve velkých centrech se IT mikrochirurgickou technikou věnují spíše jednotlivci, než skupiny pracovníků. Z tohoto pohledu je výše zmíněná nejednotnost technik a práce s tou, která je nejvíce zažitá na konkrétním pracovišti, ještě pochopitelnější.
V Institutu klinické a experimentální medicíny v Praze (IKEM) existuje již řadu let mikrochirurgická laboratoř, kde jsou prováděny experimentální transplantace ledvin, srdce a jater. Toto zázemí pomohlo autorům zvládnout základy mikrochirurgie. Autoři sdělení, kteří se technikou transplantace střeva u krysy zabývají, neměli žádné předchozí zkušenosti s mikrochirurgickou technikou.
Autoři se rozhodli pro model transplantace štěpu tenkého střeva od dospělého dárce dospělému příjemci. V prvé části bylo nutné zvládnout techniku odběru, druhá část, tedy část rekonstrukční (vlastní transplantace štěpu tenkého střeva), byla v současné době zahájena.

Metoda

Model transplantace štěpu tenkého střeva u krysy sestává ze dvou částí: odběru a samotné transplantace.
Odběr štěpu tenkého střeva u krysy - operace dárce
Zvíře je uloženo na operačním stole v poloze na zádech, všechny čtyři končetiny jsou fixovány k operačnímu stolu. V celkové anestezii (inhalační nebo intramuskulární) provádíme střední laparotomii, kličky tenkého střeva a kolon luxujeme laterálně vlevo. Všechny další části operace dárce (odběru) jsou prováděny s pomocí operačního mikroskopu. Preparujeme v retroperitoneu aortu a její větve od bifurkace až k odstupu a. coeliaca. Dvojitě ligujeme a mezi ligaturami přerušujeme levou renální žílu a tím obnažujeme přední stranu břišní aorty v celé její délce od bifurkace až k odstupu horní mezenterické tepny. Všechny větve břišní aorty (a. mesenterica posterior (inferior), aa. iliolumbales, a. ovarica (spermatica) dx. et sin., a. renalis sin. et dx.) vyjma horní mezenterické tepny a a. coeliaca dvojitě ligujeme 8/0 monofilamentním vláknem a mezi ligaturami přerušujeme. Nyní je břišní aorta mobilizovaná téměř v celém rozsahu, vyjma větví, které jsou nezbytné k zásobení štěpu. Poté oddělujeme kolon od tenkého střeva a mezokolon (drobné cévy koagulujeme, větší ligujeme), tenké střevo uvolňujeme od Treitzova vazu, oddělujeme pankreas od kolon a od duodena (duodenální arterie a žíly ligujeme a koagulujeme). Nyní klademe tenké střevo i kolon na pravou stranu. Horní mezenterická tepna není dosud dostatečně (cirkulárně) vypreparována. Proto tepnu postupně zbavujeme okolních lymfatik a ostatních tkání tak, až je její odstup z aorty cirkulárně zcela volný a aorta je také zcela zbavena větví až k odstupu a. coeliaca. Během této preparace je nutné umístit na levou stranu těla dárce. Tuto část operace lze provést v zásadě dvěma způsoby. Spolu s horní mezenterickou tepnou jde mízovod zhruba stejného kalibru jako tepna. Tento lze přerušit v místě větvení a.m.s., čímž nijak neohrozíme úspěch ani odběru, ani transplantace, nebo jej lze ponechat (eventuálně i anastomozovat) a přerušit až v retroperitoneu paraaortálně (7). Při provedení prvé varianty se operační pole ihned po přerušení mízovodu zalije mízou, což se po vysušení již zpravidla neopakuje. Druhá varianta (se zachováním mízovodu) je samozřejmě chirurgicky náročnější a pracnější. Nyní ukládáme kolon i tenké střevo zpět na pravou stranu. Játra luxujeme kraniálně a ozřejmujeme průběh porty a hepatické arterie. Portu je nutno "zbavit" všech jejích přítoků, proto tyto postupně ligujeme. Hepatickou arterii ligujeme ještě před podvazy kořenů porty, neboť při další preparaci ji lze snadno poranit. Krvácení z hepatické arterie často znamená konec pokusu, krysa netoleruje krevní ztrátu větší než cca 1 ml, operační pole je v okamžiku zalité krví, další operování včetně eventuálního ošetření zdroje krvácení bývá zpravidla nemožné. V této fázi máme vypreparovány cévní struktury, které budeme později anastomozovat. V mezenteriu mezi cévními svazky přerušujeme blanité avaskulární části v místech, kde tímto vytváříme proximální a distální hranici štěpu. Postupně ligujeme a přerušujeme větve horní mezenterické tepny a žíly před proximální hranicí štěpu, kmen žíly i tepny v mezenteriu na distální hranici štěpu ligujeme (tepnu a žílu zvlášť). Dvěma ligaturami obcházíme aortu těsně nad bifurkací a pod odstupem a. coeliaca, jednou ligaturou portu v hilu jaterním. Distální ligaturu nad bifurkací uzlíme a nad ní zavádíme kanylu, kterou fixujeme kraniální ligaturou. Uzlíme obě vlákna pod a. coeliaca a vlákno porty v hilu jaterním. Nyní začíná tzv. "studená ischemie štěpu". Krevní oběh ve štěpu je zastaven a začíná jeho proplach konzervačním roztokem s heparinem. Portu přerušujeme proximálně od ligatury, aby mohla krev ze štěpu volně vytékat nahrazována konzervačním roztokem. Po ukončení "perfuze" štěpu je přerušena aorta nad bifurkací a pod odstupem a. coeliaca a štěp je uložen do konzervačního roztoku při teplotě +4°C. Zvíře-dárce je usmrceno.

Operace příjemce

Zvíře je uvedeno do anestézie a uloženo na operačním stole stejným způsobem, jaký byl popsán u dárce. Střední laparotomie, vlastní střevo příjemce ukládáme na levou stranu tak, aby nedošlo k torzi cév, střevo včetně kolon balíme do čtverce navlhčeného teplou vodou a aluminiové fólie tak, aby během operace bylo chráněno. Všechny další části operace příjemce jsou prováděny s pomocí operačního mikroskopu. Preparujeme v retroperitoneu břišní aortu a dolní dutou žílu distálně od levé renální tepny a žíly. Štěp tenkého střeva ukládáme na levou stranu příjemce a také balíme do aluminiové folie tak, aby nebyl ohříván okolními tkáněmi během "manipulačního času" (tj. čas od vynětí štěpu z termoboxu, kde je konzervován, do zahájení reperfuze krví příjemce). Technika revaskularizace štěpu je v podstatě dvojí:

1)štěp je anastomozován na aortu a dolní dutou žílu: End-to-side anastomóza horní mezenterické tepny (eventuálně se štěpem aorty) štěpu na aortu příjemce pokračujícím monofilamentním stehem 10/0, end-to-side anastomóza horní mezenterické žíly (event. porty) na dolní dutou žílu příjemce pokračujícím monofilamentním stehem 10/0.
2)štěp je anastomozován na levou renální žílu a tepnu po provedení levostranné nefrektomie příjemce (obě anastomózy jsou provedeny end-to-end).

Po našití anastomóz uvolňujeme nejprve svorku žilní, poté svorku tepennou. Po revaskularizaci štěpu uvolňujeme tenké střevo od Treitzova vazu až k céku a resekujeme jej. Cékum vracíme zpět do dutiny břišní a proximální konec štěpu našíváme za Treitzův vaz na proximální jejunum příjemce end-to-end pokračujícím (jednotlivými) 8/0 stehem. Distální anastomózu lze provést stejným způsobem na pahýl terminálního ilea. Pokud se rozhodneme pro provedení modelu, u kterého je obnovení kontinuity střeva prováděno za 7 dnů po transplantaci, šijeme terminální stomii distálního konce štěpu a pahýl terminálního ilea slepě uzavíráme. Dutinu břišní příjemce uzavíráme ve dvou vrstvách, svalovou vrstvu 3/0 Vicryl (Catgut) a kůži 3/0 kožním stehem.
Po výkonu podáváme příjemci šest mililitrů 0,9% NaCl subkutánně do oblasti šíje. Během uzávěru laparotomie již ukončujeme podávání inhalačního anestetika. Po odeznění anestezie ukládáme zvíře do boxu, nutné je zabezpečit dostatečnou oxygenaci a hydrataci.

Diskuse

Výše popsaný model byl zaveden do experimentální praxe v IKEM. Výběr modelu transplantace tenkého střeva je závislý na několika faktorech, zejména na zkušenosti mikrochirurgického pracoviště a vlastních experimentátorů a druhu studie, pro kterou je model použit. Model transplantace fetálního či novorozeneckého střeva jako "volného štěpu" do omenta dospělého příjemce je vhodný především k výzkumu imunosuprese. Výše popsaný model s resekcí tenkého střeva příjemce a obnovením kontinuity střeva štěpem je vhodný pro dlouhodobé studie, kdy je příjemce zcela závislý na funkci štěpu, resp. jeho nutričních a funkčních vlastnostech.
Někteří autoři udávají i více než roční přežití experimentálních zvířat (4), někteří naopak poukazují na "dubiózní" výsledky dlouhodobých studií nutričních a funkčních vlastností štěpu (8). To, co je dosud limitující pro úspěch těchto modelů, jsou především technické aspekty. Manipulační čas se pohybuje mezi 45 a 60 minutami (4). Samotný odběr trval autorům zpočátku kolem čtyř hodin, nyní se podařilo zkrátit čas odběru na dvě až dvě a půl hodiny. Zhruba stejné časy jsou popisovány v zahraniční literatuře. U dlouhodobých studií je hlavním faktorem přežití příjemce, někteří autoři (9) resekují jen 25, 50 či 75 % tenkého střeva příjemce. To má za následek, že příjemce v časném pooperačním období (než nastoupí plná funkce štěpu) neztrácí na váze (ztráta se jinak pohybuje kolem 25 % váhy předoperační). To, že příjemce metabolicky nestrádá, je jedním z hlavních faktorů, které ovlivňují přežití. V případě dodržení manipulačního času do 60 minut a pokud následně nastoupí funkce štěpu, příjemci opět přibývají na váze v 83 % (4,8,10). Některá pracoviště používají model s dočasnou stomií, kde je kontinuita střevní obnovena 7. pooperační den (11).
Technika perfuze štěpu bývá dalším úskalím tohoto experimentu. Jednotlivá pracoviště postupují různě. Tato problematika se netýká jen proplachu štěpu tenkého střeva, ale i například experimentálního modelu transplantace jater. Proplach lze provést několika způsoby. Prvé dva způsoby lze nazvat "manuálními", proplach je prováděn s pomocí kanyly zavedené do aorty dárce a injekční stříkačky (lépe bezodporové), proplach lze provést v těle příjemce nebo po explantaci štěpu. Většina autorů dává dnes přednost proplachu in vivo. Další možností je provést proplach s pomocí setu, kdy perfuzní roztok je zavěšen (35 cm až 1 m) nad operačním stolem (12), vzhledem ke kalibru perfundovaných cév a viskozitě perfuzních roztoků lze u tohoto modelu perfuze očekávat, že některé štěpy nejsou dobře promyty, což je významný limitující faktor pro další úspěch transplantace (13). Některá pracoviště pracují na vývoji systému ("pumpy"), který zaručí přesně definovanou perfuzi (konstantní teplotu perfuzního roztoku a konstantní rychlost perfuze) (14).

Závěr

Autoři se v této publikaci pokusili popsat model transplantace štěpu tenkého střeva v experimentu - na krysím modelu. Tento model je ve světě používán v různých modifikacích. Většina experimentálních pracovišť upravuje a modifikuje některé části modelu v době jeho zavedení do experimentální praxe a následně dle výsledků jednotlivých experimentů. I my jsme provedli některé změny oproti popisovaným operačním postupům, částečně se nám tak spolu s přibývajícími zkušenostmi podařilo zkrátit dobu odběru. Zda tyto úpravy byly vhodné, ukáží až výsledky následujících experimentů, ve kterých hodláme tento model použít.

Literatura

  1. Carrel, A.: La technique opératione des anastomoses vasculaires et la transplantation des viscéres. Liv. Méd 98, 1902: 859-865
  2. Mäkisalo, H., Ericzon, BG.:Intestinal transplantation. Annales Chirurgiae et Gynecologiae 86, 1997: 155-162
  3. Grand, D., Wall, W., Mineault, R., Zhong, R., Ghent C., Garcia, B., Stiller, C., Duff, J.: Successful small-bowel/liver transplantation. Lancet 335, 1990: 181-184
  4. Scholten, E., Werken, PMN., Green, CJ., Kon, M.: Experimental orthotopic small bowel transplantation: a revised model. Microsurgery 17, 1996: 409-413
  5. Froněk, J., Ryska, M.: Transplantace tenkého střeva v experimentu. Bulletin HPB 1, 2001: 14-16
  6. Lopez, MFSC., Cartucho, DJF., Cabrita, AMS., Patricio, JAB.: Techniques of intestinal transplantation in rat. Microsurgery 18, 1998: 424-429
  7. Kellersman, R., Zhong, R., Kiyochi, H., Garcia, B., Grant, DR.: Reconstruction of the intestinal lymphatic drainage after small bowel transplantation. Transplantation 69, 2000: 10-16
  8. Shimazu, R., Raju, S., Grogan, JB.: A tribute to the late Dr Ryo Shimazu: A chronic bowel allograft model in the rat. Microsurgery 11, 1990: 293-295
  9. Nygaard, K.: Resection of the small intestine in rats. Acta Chirurgica Scandinavica 132, 1966: 731-742
  10. Zhong, R., Wang, P., Chen, H., Sutherland, F., Horlbut, D., Lamont, D., Duffy, Y., Grant, D.: A comparison of heterotopic and orthotopic rat intestinal transplant models. Transplant Proceedings 22, 1990: 2445
  11. Moore, G.H., Roza, A.M., Johnson, C.P., Telford, G.L., Adams, M.S.: Small bowel transplantation in the rat within immediate restoration of intestinal continuity. Microsurgery 11, 1990: 300-302
  12. Van Oosterhout, J.M.: Small bowel transplantation: An experimental study in the rat. Dissertation, Nijmegen, Holland, 1982.
  13. Scholten, E.: Small bowel preservation: A morphological and functional study. Dissertation, Utrecht, Holland, 1995
  14. Luther, B., Wolff, H., David, H., Lehmann, C.H.: Results of the perfusion and preservation of animal and human small bowel transplant. Transplant Proceedings 22, 1990: 24.

Adresa pro korespondenci:

MUDr. Jiří Froněk
Klinika transplantační chirurgie
IKEM
Vídeňská 1958/9
140 21 Praha 4
E-mail: jiri.fronek@quick.cz